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太岁样品中细菌的多样性(王朝江)

来源:王朝江作者:王朝江网址:http://www.csbly.com浏览数:48 
文章附图

王朝江

( 河北省农林科学院 遗传生理研究所河北 石家庄 050051) 通过构建 16S rDNA 克隆文库的方法分析太岁样品中细菌的群落结构及多样性太岁样品中的细菌归属于 4 个门 9 个目优势类群依次是芽胞杆菌目( Bacillales3301% ) 柄杆菌目( Caulobacterales3204% )和伯克霍尔德氏菌目( Burkholderiales1262% ) ; 优势属为短波单胞菌属( Brevundimonas3010% ) 葡萄球菌( Staphylococcus2913% ) 和食酸菌属( Acidovorax777% ) 并且其中的 5 个目中含有未培养的细菌红杆菌目( hodobacterales) 伯克霍尔德氏菌目和红环菌目( hodocyclales) 11 个克隆子的细菌 16S rDNA 序列同源性低于 97% 研究表明太岁样品中细菌多样性较丰富且蕴藏着许多未知的微生物资源关键词 16S rDNA; 克隆文库; 太岁; 细菌多样性中图分类号 Q938 文献标识码 A 文章编号 1005 7021( 2017) 03 0095 05 doi: 103969 /jissn1005 7021201703015


Analysis of Bacterial Diversity by 16S rDNA Clone Library from Taisui Sample WANG Chao-jiang ( Instof Genetics PhysiolHebei Acadof AgricForestry SciShijiazhuang 050051)

Abstract The bacterial community structure and diversity of Taisui sample were analyzed through the construction of 16S rDNA clone librariesBacteria in Taisui sample belonged to 4 phyla and 9 ordersThe dominant orders of bacteria were Bacillales ( 3301% ) ,Caulobacterales ( 3204% ) and Burkholderiales ( 1262% ) The most dominant genus was Brevundimonas ( 3010% ) ,the secondary dominant genus was Staphylococcus ( 2913% ) ,followed by Aci- dovorax ( 777% ) There were uncultured bacteria of 5 orders among themand 11 clones from hodobacteralesBurkholderiales and hodocyclales of bacterial 16S rDNA sequence homology were less than 97% The results indica- ted that high bacterial diversity was found in Taisuialso there were many unknown microbial resourcesKeywords 16S rDNA; clone library; Taisui; bacterial diversity


太岁又称肉灵芝本草纲目中描述为肉芝状如肉乃生物也白者如截肪黄者如紫皆光明洞彻如坚冰也”。太岁生活于土壤中生命力极强有研究称太岁在抑菌调节免疫性肿瘤等疑难杂症的治疗方面具有明显效果此受到社会各界的广泛关注太岁特有的弹性韧性和粘性极易使人直觉上判定是一种生物体但到目前为止生物学界却一直难以给出归属较流行的观点认为是大型黏菌复合体但仍有人持太岁为非生命体的观点戴璐1研究了渭河太岁衍生体中黏菌和真菌多样性分离出 2 种黏菌和 18 种真菌; 王欣2研究了上述同一样本中细菌多样性获得 35 株细菌和 1 株黏细菌优势菌群为 β-变形菌纲伯克氏菌目( Burkholderiales) 细菌; 林涧等3也开展了类似的工作; 郑科研等4通过研究渭河太岁化学组成推测其是以聚乙烯醇为主含少量多糖和各种杂菌的不明物体; 朱春玉等研究了太岁的营养组成指出其含有核酸白质等基本生物体构成要素倾向于支持太岁是生命体的观点5但过低的核酸含量则不能确认其来源于太岁本身还是太岁中的杂菌本文作6在分析了中国现代太岁 228 次发现报道后明确了太岁存在的客观性和研究的必要性进一步分析各种太岁中微生物的多样性及其与太岁本体的关系为认识太岁属性揭示生命特征提供科学依据8888888888888.jpg

1 材料与方法

11 材料

111 供试样品 太岁由北京电视台科教节目记者转赠外观白色肌纤维状手触有弹性并略有粘性发现地为吉林长春笔者保藏编号 004112 试剂与仪器 Ezup 柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒dNTP( 上海生工生物工程股份有限公司) ,pMD 18-T Vector 连 接 试 剂 盒 ( Takara 公 司) ,Dream Taq-TM DNA Polymerase( MBI) ; 3730XL 测序仪( Applied Biosystems) ,HC-2518冷冻高速离心机( BBI) ,PC扩增仪( Applied Biosystems) ,F980凝胶成像仪( 上海复日科技仪器有限公司) ,TH2-C恒温摇床( 太仓市实验设备厂)

12 方法

121 DNA 提取 为减少外界杂菌的影响测试取样切自有胶质层包裹的边缘紧密组织块用无菌水震荡洗涤 200 无菌滤纸吸干表面水分切去暴露的表层剩余部分用于 DNA 的提太岁切块组织匀浆机捣碎后Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取总 DNA122 PC扩增 以提取的 DNA 为模板采用16S rDNA 扩增通用引物 7F( CAGAGTTTGATCCT- GGCT) 1540( AGGAGGTGATCCAGCCGCA) PC7PC反应体系: 5 × Buffer( with Mg2 + ) 25 μLdNTP( 25 mmol /L) 2 μL7F( 10 μmol / L) 05 μL1540( 10 μmol /L) 05 μLTaq DNA聚合酶 02 μLDNA 模板 05 μLddH2O 25 μLPC反应条件: 98 预变性 3 min; 98 25 s55 复性 25 s72 延伸 1 min30 个循; 72 延伸 10 min

123 16S rDNA 克隆转化和文库的构建 得到的 PC产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化后pMD 18-T 载体连接转化到大肠埃希菌 DH5αAmp-Xgal /IPTG 抗性筛选平板选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子构建 16SrDNA 克隆文库( 上海生工生物工程股份有限公司) 124 16S rDNA 克隆文库分析 测序结果用Mothur 软件剔除嵌合序列划分操作单元( Opera- tional Taxonomic UnitOTU) 通过 Shannon-Wie- ner 多样性指数( H) 8及均匀度指数( E) 分析细菌的多样性

H = s i = 1PilnPi   E = H / ln S

S 表示克隆文库中 OTU 总数Pi 表示第 i OTU 在克隆文库中所占比例文库覆盖率( C) 算公式: C = ( 1 n1N ) × 100%

其中 N 为阳性克隆子总数; n1 为仅含单个克隆子的 OTU 数量9

125 构建细菌 16S rDNA 系统发育树 测序结果利用 BLAST 软件( http: / /wwwncbinlmnihgov /blast /BlastCgi) GenBank 数据库中的序列进行比对分析选取同源性最高且合格发表的 菌 株 序 列利 用 MEGA5 软 件采 用 邻 接 法( neighbor-joining method) 构建系统发育树代表克隆文库序列提交 GenBank

2 结果与分析

21 DNA 提取和 PC扩增对太岁样品提取的总 DNA 进行电泳检测带大小为 2 000 bp 左右DNA 片段完整并用细16S rDNA 的通用引物 7F 1540扩增 16S rDNA 片段结果如图 1 所示由图 1 可知16S rDNA 片段约 1 500 bp

22 太岁样品 16S rDNA 文库的多样性随机挑取太岁 样 品 16S rDNA 克 隆 文 库 中103 个阳性克隆子并进行测序( 序列长约为 800 bp) ,结果如表 2 所示代表克隆文库序列提交GenBank序列 登 录 号 为: KX579862 KX579878 KX686139 KX686143103 个阳性克隆共分22 OTU其中 9 OTU 只含有一个克隆子计算覆盖率 C 值为 91% 说明本研究检出的微生物在一定程度上可以反映样品的细菌群落结构计算 Shannon-Wiener 多样性指数 H 222均匀度指数 E 072由此可看出太岁样品中细菌多样性较丰富且比较均一

1 太岁样品细菌 16S rDNA PC扩增产物Fig1 PCamplification of the bacteria 16S rDNA from " Taisui"加粗的 5001 0003 000 分别表示 Marker 中相应条带大小500 bp1 000 bp3000 bp the size of stripes corresponded to bold Markers are 500 bp1 000 bp3 000 bp

由序列比对结果可知太岁样品中细菌种类丰富22 OTU 共归属于 4 个门的 9 个目其中变 形 菌 门 的 67 个克隆子所占比例最大( 65. 05% ) ,包含 6 个目: 柄杆菌目( Caulobactera- les) 33 个克隆子所占比例为 3204% ; 伯克霍尔德氏菌目( Burkholderiales) 13 个克隆子所占比例为 1262% ; 红环菌目( hodocyclales) 7 克隆子所占比例为 680% ; 根瘤菌目( hizobia- les) 5 个克隆子所占比例为 485% ; 红杆菌目( hodobac-terales) 5 个 克 隆 子所 占 比 例 为4. 85% ; 鞘氨醇单胞菌目( Sphingomonadales) 4个克隆子所占比例为 388% 厚壁菌门的 34 克隆子都归属于芽胞杆菌目( Bacillales) ,所占比例为 3301% 疣微菌门的疣微菌目( Verrucomi- crobiales) 和浮霉菌门的浮霉菌目 ( Planctomyce- tales) 都只有 1 个克隆子且为未培养细菌由此可知本研究太岁样品中最优势类群为芽胞杆菌( 33. 01% ) ,次优势类群为柄杆菌目( 32. 04% ) ,然后是伯克霍尔德氏菌目( 1262% ) 另外本研究太岁样品 16S rDNA 隆文库 22 OTU OTU5 31 个克隆子为短波单胞菌属( Brevundimonas30. 10% ) ,是最优势属; OTU21 30 个克隆子为葡萄球菌属( Staphylococ- cus29. 13% ) ,是次优势属; 然后 OTU1 8 个克隆子为食酸菌属( Acidovorax777% ) ; 其他 OTU所占比例均小于 4%

由表 2 可知构建的 16S rDNA 文库中的克隆子与 GenBank 数据库中已知细菌的 16S rDNA 列相似性最高为 100% 最低为 90% 其中 92 克隆子( 8932% ) 与已知序列相似性高于 97% 11 个克隆子( 1068% ) 与已知序列相似性低于97% 本研究中 16S rDNA 克隆文库的 5 个目( 杆菌目伯克霍尔德氏菌目红环菌目疣微菌目浮霉菌目) 22 个克隆子为未培养的细菌; 3 ( 红杆菌目伯克霍尔德氏菌目红环菌目) 11个克隆子与已知细菌的 16S rDNA 序列差异性较同源性最低的仅为 90%这说明太岁样品中不仅含有丰富的已知细菌还蕴藏着许多未知及未培养的细菌有进一步深入研究和开发的价值

23 太岁样品中

16S rDNA 系统发育分析测序结果利用 BLAST 软件与 GenBank 数据库中的序列进行比对分析选取同源性最高且合格发表的菌株序列利用 MEGA5 软件采用邻接法构建系统发育树结果如图 2由图 2 可知岁样品克隆文库有 22 OTU其中 21 OTU 别与变形菌门厚壁菌门和疣微菌门的细菌聚集在一起另有 OTU22 与浮霉菌门的未培养细菌聚集在一起形成单独的一支该结果与序列比对结果相一致


3

本研究太岁样品 16S rDNA 克隆文库的 103个阳性克隆子共得到 22 OTU 归属于 4 个门的9 个 目其中优势类群依 次是芽胞杆菌目( 33. 01% ) 柄杆菌目( 32. 04% ) 和伯克霍尔德氏菌目( 12. 62% ) 其中5 个目的22 个克隆子为未培养的细菌3 个目的 11 个克隆子细菌 16S rDNA序列同源性低于 97% 这说明太岁样品中的细菌不仅有较丰富的多样性而且蕴藏着许多未知的微生物资源有待进一步深入研究

本研究太岁样品中细菌的优势属为短波单胞菌属( 30. 10% ) 葡萄球菌属( 29. 13% ) 和食酸菌( 7. 77% ) 短波单胞菌属的琼脂糖酶产生菌能将琼脂降解为琼脂寡糖琼脂寡糖具有抗癌氧化抗病毒等生理活性被广泛应用于医药领10这可能与太岁对一些疑难杂症有特殊的疗效密切相关另外短波单胞菌属细菌还能降解木质纤维素11有机磷农药12和原油13等物质这个属的细菌多见于水体中有研究表明东居延14和北极海水15中都是短波单胞菌属为优势种群食酸菌属含有多种降解菌能降解苯酚及苯衍生物16腐植酸17喹啉18聚羟基丁酸戊酸共聚酯( PHBV) 19β-环柠檬醛20等难降解物质以上结果表明太岁样品中细菌优势种群具有降解多种环境物质的作用这可能与太岁在土壤环境中的生长有关但仍需进一步研究而葡萄球菌属细菌在太岁中的作用尚不清楚

王欣2对渭河太岁衍生体中细菌多样性分析表明其体内的优势细菌种群为伯克氏菌目本研究太岁样品的伯克霍尔德氏菌目不是最优势细菌类群所占比例为 12. 62% 芽胞杆菌目为本太岁样品的最优势类群两个研究中优势菌群的不同可能与太岁样品不同样品采集地及保藏处理方式不同有关另外林涧等3发现其太岁 1号样品包含葡萄球菌属白色侧齿霉菌假丝酵母本研究太岁样品中的细菌也包含了葡萄球菌综合分析发现生长在不同环境中的太岁体内的微生物类群及优势种群存在差异而不同太岁的细菌组成是否存在一定规律及差异形成的机理等还有待大量的研究证明

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20代志刚蒋永光谷依露异味物质 β-环柠檬醛降解菌的分离和鉴定J水生生物学报201432( 2) : 222- 226

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