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神奇东方万物生 太岁福泽有缘人
 
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太岁样品分离菌的初步研究

来源:【 军事医学研究院 生物工程研究所】作者:佟嘉辉、熊向华、汪建华、徐威、张惟材网址:http://www.csbly.com浏览数:29 
文章附图

佟嘉辉1,2熊向华2汪建华2徐威1张惟材2 1. 沈阳药科大学辽宁 沈阳 1100162. 军事医学研究院 生物工程研究所北京 100071摘要目的太岁是自然界中一种未知生命体本实验对 2例来源地不同的太岁样品进行菌株分离培养与鉴定方法太岁经表面消毒后无菌研磨采用多种培养基涂板以分离可培养菌株并进行16S rDNA18S rDNA序列PCR扩增测序及 Blast 比对结果2 例太岁样本中分别获得 4 株相似菌株经鉴定分离菌株 TS-1 为荧光假单胞菌Pseudomonas flulorescens),TS-2 为地中海短波单胞菌Brevundimonas mediterraneaTS-3 为红串红球菌Rhodococcus erythropolis),TS-4为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.)。结论2例来源不同的太岁中均含有上述4种菌株在生物学组成中具有一定的共性为研究太岁的形成提供了新的思路关键词太岁分离培养多样性分子鉴定中图分类号Q939 文献标识码A 文章编号1009-0002201802-0238-05Preliminary Study of Strains Isolated from DifferentTaisuiSamplesTONG Jia-Hui1,2, XIONG Xiang-Hua2, WANG Jian-Hua2, XU Wei1*, ZHANG Wei-Cai2* 1. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016; 2. Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071; China*Co-corresponding authors, XU Wei, E-mail: shxuwei8720@163.com; ZHANG Wei-Cai, E-mail: drzhangweicai@163.comAbstractObjective: "Taisui" is an undefined organism existed in nature. In this experiment, molecular biological identification and chemical analysis were carried out with strains isolated from different Taisui samples. Methods: A variety of culturemedium was used to isolate and identifty the cultured strains. 16S rDNA, 18S rDNAwere amplified by PCR from crude DNA. The PCR fragments were then ligated into pMD18T and sequenced.Strain identification was performed by sequence alignment against NCBI GenBank. Results: Strain TS-1 was identified as Pseudomonas fuorescen, TS-2 as Brevundimonas mediterranea, TS-3 as Rhodococcus erythropolis, TS-4 asSphingomonas sp. Conclusion: Some biological uniformity found in this two Taisui samples from different source.Key wordsTaisui; isolation and culture; diversity; molecular identification

太岁也称肉芝明代李时珍著本草纲目[1]中对其描述为:“肉芝状如肉附于大石头尾具乃生物也赤者如珊瑚白者如截肪黑者如泽漆青者如翠羽黄者如紫金皆光明洞彻如坚冰也。”太岁样品多发现于土层中[2]形如肉体型较大表面光滑湿润颜色多样至今生物学界对其归类仍未给出明确答案郑科研等[3]通过研究太岁样本的化学组成推测其主体为聚乙烯同时含有少量多糖及各种杂菌朱春玉[4]等则测定了太岁中核酸多糖蛋白质等各生物体组成要素含量西北大学戴璐[5]在对太岁样本的衍生体进行菌分离时共分离得到 2 种黏菌和 18 真菌王欣[6]从上述同一样本中分离得到 35 种细菌和 1 种黏细菌其优势菌群属β-变性菌纲伯克霍尔德菌目Burkholderiales);林涧等[7]2 例太岁样品中分离得到假丝酵母Candida和黏质红酵Rhodotorula mucilaginosa)。本实验室收集了10 余例来自不同地区的太岁样本着重对其中 2例样本的分离菌株进行分子生物学鉴定及分析以期获得对太岁样品的生物学本质及其组成的初步认识1 材料与方法1.1 材料黄 色 太 岁编 号 YF142)、白 色 太 岁编 号ZWG0525样品由本实验室保存大肠杆菌 DH5α感受态三氟乙酸TFA)、7 种单糖标准品葡萄Glc)、甘 露 糖Man)、半 乳 糖Gal)、鼠 李 糖Rha)、阿拉伯糖Ara)、葡萄糖醛酸GlcUA)、乳糖醛酸GalUA)]、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根生化科技有限公司pMD18T 载体购自 宝 生 物 工 程大 连有 限 公 司 DNA markersHifi Taq DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮PMP自生工生物公司甲醇磷酸葡萄糖等试剂购自国药集团化学试剂有限公司引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成Olympus BX-51 显 微 镜WH 10×/22100×/1.35 oil Iris);Waters 600 高效液相色谱仪Waters Xbridge-C184.6 mm×150 mm色谱柱1.2 太岁样品预处理太岁样品表面消毒[8]于超净台中切取块状太岁样品75%酒精浸润 12 min 后用无菌水反复冲洗振荡若干次回收最后一次冲洗液取适量涂布于培养基平板上30恒温培养以检测消毒效果1.3 太岁样品的菌分离及其分子生物学鉴定1.3.1 太岁样品分离菌的获取 采用林涧等[7]述菌株分离法获取分离菌株涂布于真菌培养基平板上包括无抗及卡那霉素抗性 YPD 培养基无抗及卡那霉素抗性麦芽汁培养基虎红培养基及沙氏培养基),30恒温倒置培养 3 d挑取单菌落平板划线培养1.3.2 太 岁 样 品 分 离 菌 16S rDNA18S rDNAITSNS 序列测定 50 μL 反应体系[7]1 μL 取的太岁样品总 DNA 为模板16S rDNA PCR 增条件9510 min9530 s50退火 30 s72延 伸 90 s循 环 30 7210 minITS 18S rDNA 扩 增 条 件 9510 min9530 s55退 火 30 s72延 伸 90 s循 环 30 7210 minPCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳用胶回收试剂盒切胶回收目的基因后一部分直接进行测序一部分连接 pMD18T 载体选取阳性克隆后进行测序将基因序列与 GenBank 数据库进行Blast 比对确定分离菌株的分类位置1.4 太岁样品分离菌多糖组成分析1.4.1 鞘氨醇单胞菌属发酵多糖分离 YPD 培养基于 30发酵培养 72 h 沸水浴溶解发酵液12 000 r/min 离心 10 min 提取上清液加入 2 量的 95%乙醇4过夜醇沉12 000 r/min 离心10 min 得到分泌的胞外多糖1.4.2 多糖样品水解 1 mL 提取的多糖样品置于具塞试管中加入 2 mol/L TFA 2 mL涡旋混匀110水解 8 h取出冷却至室温12 000 r/min 离心 5 min取上清0.2 mol/L NaOH 溶液pH 值至 7将水解液定容至 10 mL1.4.3 衍生化 准确称取上述 7 种单糖标准品配制 100 μg/mL 单糖标准品溶液及混糖溶液萄糖半乳糖甘露糖阿拉伯糖终浓度为 50 μg/mL葡萄糖醛酸半乳糖醛酸鼠李糖终浓度为5 μg/mL 的溶液);取各单糖标准液混合糖标准液和样品溶液 100 μL 置于不同试管中依次加50 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液和 50 μL 0.2mol/L NaOH 溶 液 涡 旋 混 匀 70水 浴 反 应 40min冷却至室温加入 100 μL 0.3 mol/L HCl 液中和400 μL 氯仿萃取涡旋 4 min 混匀4500 r/min 离心 5 min取上层水相重复 3 层水相经滤器过滤混匀待用20 μL 进样分析

表1.png

1.4.4 HPLC 分析条件 Waters Xbridge-C18 标准液进样量 20 μL样品进样量 50 μL柱温25检测波长 250 nm流动相 A 15%乙腈磷酸盐缓冲液50 mmol/LpH6.9),流动相 B 40%乙腈磷酸盐缓冲液50 mmol/LpH6.9);梯度模式设置时间为 0103040 min 相应浓度梯度为 0%10%30%0%流动相 B2 结果2.1 太岁样品的形态学观察编号 YF142 的黄色太岁样品外观为黄褐色肉有弹性有条纹带内部成束状并伴有少量白色硬结表面光滑湿润编号 ZWG0525 的白色太岁样品体型较大外观为白色有弹性表面光滑湿润有类似蕈菌类的伞盖和薄膜切割时有韧见图 1

图一.png

2.2 对太岁样品中分离得到的 4 株共性菌的初步研究2 例太岁样品进行菌株分离通过培养观察及 Blast 比对结果表明 2 例太岁样品中均含有以下 4 种原核菌株TS-1 号菌株为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens),TS-2 号菌株为地中海短波单胞菌Brevundimonas mediterranea16SrDNA 部 分 序 列 上 传 至 GenBank序 列 号 为 MF668251长度为 1331 bp),TS-3 号菌株为红串红球菌Rhodococcus erythropolis),TS-4 号为鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.菌株见图 22表二.png

2.3 鞘氨醇单胞菌属分离菌的初步研究文献调研表明鞘氨醇单胞菌属在生物降解

方面具有优势与太岁较为类似同时鞘氨醇单胞菌属可分泌胞外多糖推测其可能与太岁的形成有关因此着重对其进行研究采用鞘氨醇单胞菌特异引物732 F/982 R[9]对提取的太岁DNA 进行 PCR 扩增得到一条约 250 bp 的条测序结果表明在提取的太岁总 DNA 中存在鞘氨醇单胞菌基因并非污染产生采用 YPD 培养基培养 TS-4 分离菌30发酵72 h 后形成黄色冻状物3),沸水浴溶解发酵液后12 000 r/min 离心 10 min 提取上清液加入2 倍量的 95%乙醇于 4过夜醇沉12 000 r/min离 心 10 min 得 到 分 泌 的 胞 外 多 糖4),通 过HPLC 对其单糖组成进行分析2.4 HPLC 分析多糖的单糖组成混 糖 标 准 品 PMP 衍 生 后 进 样 梯 度 流 动 相HPLC 分离结果见图 5鞘氨醇单胞菌属分离菌发酵多糖 PMP 衍生后进样梯度流动相 HPLC 分离结果见图 6确认其由甘露糖鼠李糖葡萄糖组经标准品峰面积定量后对样品进行分析相对摩尔比约为 613图三.png

图三1.png

3 讨论太岁是自然界中存在的一种特殊的未知生命体至今生物学界对其归类仍未给出明确答1992 年西北大学对首例太岁样本进行了分析鉴定认为太岁是一种特大型罕见黏菌复合”,并获得一定认可我们通过微生物学角度研究太岁样本的菌种组成以期初步了解太岁的生物多样性采用多种真菌分离培养基对上述 2例太岁样品进行菌分离时从无抗性 YPD 及麦芽汁培养基平板中分离得到多株相同形态的不同菌株测序鉴定结果均为细菌并且 2 例太岁样品中均含有上述 4 株菌株经文献调研河北师范大学李亮等在 NCBI 提交的太岁浸液中的 29 例菌种信息其中 10 例为短波单胞菌属5 例为鞘氨醇单胞菌属3 例为假单胞菌属与我们的结果很相似结合王朝江[10-11]通过构建 16S rDNA 文库分析太岁样品细菌多样性的结果我们认为 2 来源地不同的太岁之间可能在生物学组成上存在一定的相似性也提示不同太岁间存在一定的生物共性

图四.png

图五.png

我们发现上述 2 例太岁样品菌分离得到的菌株均为细菌并未从中获得真菌而在对其他较新鲜的太岁样品进行菌株分离时得到了 2 株酵经鉴定其中一株为汉逊德巴利酵母Debaryomyces hansenii),推测可能是某些太岁样品的组织层较厚不易破碎真菌含量相对较低或不易在实验室条件下获得并培养现有分离手段不完善或样品保存条件等原因所致因此获取新鲜的太岁样品对于太岁的研究非常重要

图六.png志 谢 江 苏 靖 江 太 岁 金 波 生 物 科 技 有 限 公上海收藏协会太岁传习所陈建平张网根跃峰王莉莉为本研究提供了太岁样本特此致参考文献[1] 李时珍. 本草纲目[M]. 上海: 商务印书馆, 1954. [2] Wang Chaojiang, Wang Shiqing. A research of thefinding and distribution law of Taisui in modern China [J]. Agric Sci, 2015,6:407-414. [3] 郑科研, 董兆麟. 不明物体太岁的初步研究[J]. 西北大学学报, 2010,40(6):12-17. [4] 朱春玉, 白婷婷, 姜秋实, .太岁生物学组分的研[J]. 微生物学杂志, 2011,31(1):1-5. [5] 戴璐.大型黏菌复合体黏菌和真菌多样性的初步研[D]. 西安: 西北大学, 2007. [6] 王欣.大型粘菌复合体细菌多样性及抑菌功能初步研究[D]. 西安: 西北大学, 2007. [7] 林涧, 熊向华, 葛欣, . 2种太岁样品中微生物的分离和鉴定[J]. 生物技术通讯, 2013,24(6):825-827. [8] 刘宏生, 朱春玉. 一种从太岁中提取基因组的方法[P]. 中国: 200910220112.7. 2009-11-24. [9] 周丽莎, 李慧, 张颖, . 石油污染土壤鞘氨醇单胞菌遗传多样性 16S rDNA-PCR-DGGE 分析[J]. 土壤学报,2011,48(4):804-812. [10] 王朝江. 16S rDNA 克隆文库方法分析太岁样品中细菌的多样性[J]. 微生物学杂志, 2017,37(3):95-99. [11] 王朝江, 王世清. 基于高通量测序技术对三种太岁样品细菌组成的分析[J]. 湖北农业科学, 2017,56(13):2543-2547.


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