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一种太岁样品中微生物的分离和鉴定

来源:中国军事医学科学院 生物工程研究所作者:林涧 ,熊向华 ,葛欣,汪建华 ,苏昕 ,张惟材网址:http://www.csbly.com浏览数:61 
文章附图

林涧 12熊向华 1葛欣 1汪建华 1苏昕 2张惟材 1 1. 军事医学科学院 生物工程研究所 北京 1000712. 沈阳药科大学辽宁 沈阳 110016摘要目的太岁是自然界中一种组成及分类尚不明确的生物体采用分子生物学方法对 2 种不同来源地的太岁样品进行菌种分离培养和分子鉴定方法太岁表面经 75%乙醇消毒处理后用麦芽汁培养基分离可培养菌株提取太岁及分离菌株基因组 DNA以之为模板16S rDNA18S rDNA ITS 通用引物进行 PCR 扩增扩增片段连入pMD18T 载体并测序通过序列比对对太岁菌种组成进行初步鉴定结果从太岁 1 号样品中分离到假丝酵母Candida和粘质红酵母Rhodotorula mucilaginosa),从太岁 2 号样品中分离到根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens粘质红酵母结论2 种来源不同的太岁样品中均存在可培养的粘质红酵母关键词太岁生物多样性培养分子鉴定中图分类号Q78 文献标识码A 文章编号1009-0002201306-0825-03Isolation and Identification of Microbial Strains in Two DifferentTaisui SamplesLIN Jian1,2, XIONG Xiang-Hua1, GE Xin1, WANG Jian-Hua1, SU Xin2, ZHANG Wei-Cai1* 1. Beijng Institute of Biotechnology, Beijing 100071; 2. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016; China*Corresponding author, E-mail: ammsmelab@126.comAbstractObjective: Taisui is an organism with undefined classification existed in nature. The object of thisstudy was to isolate and molecular identity strains in two Taisui samples obtained from different source by molecular method. Methods: After washing with 75% ethanol for about 10 s, the Taisui samples were inoculated intomalt wort medium to obtain the cultured strains. Genomic DNA of Taisui samples were isolated and used as thetemplate to amplify 16S rDNA, 18S rDNA and ITS by PCR. The PCR fragments were then ligated into pMD18Tand sequenced respectively. Strain identification was performed by sequence alignment against NCBI GenBank. Results: Candida and Rhodotorula mucilaginosa were found in No.1 sample while Agrobacterium tumefaciens and R.mucilaginosa were found in No.2 sample. Conclusion: Rhodotorula mucilaginosa was found in these two Taisuisamples from different source.[Key words] Taisui; microbial diversity; culture; molecule identify

太岁又称肉灵芝是一种未知的生命体有研究称肉灵芝在调节免疫恶性肿瘤等疑难杂症的治疗方面具有明显效果因此受到社会各界的广泛关然而关于太岁的本质及药理作用目前还存在较大争议明代李时珍在本草纲目中对其有记并列举了几种与其相关的药方但目前其药用价值并没有得到有效的科学考证本实验室收集了10 种来自不同地区的太岁样品我们重点对其中的2 个样品进行了分子生物学及分离菌株的鉴定期对太岁的生物学本质及其微生物组成有初步的认并希望从中得到有药用价值的菌株及活性成分

1 材料与方法1.1 材料太岁样品 1 发现于新疆伊犁由中央电视台走近科学栏目组转赠太岁样品 2 由北京大兴区刘志军先生惠赠大肠杆菌 DH5α感受态琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒普通质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司载体 pMD18T 购自宝生物工程大连有限公司DNA markersHifi Taq DNA 聚合酶dNTP 自北京全式金生物技术有限公司麦芽汁培养基购自广东环凯微生物科技有限公司引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成1.2 太岁样品的菌种分离1.2.1 太岁样品的表面消毒[1-2] 将切好的块状太岁样品用自来水冲洗 10 min然后用 75%的酒精浸润10 s再用 10 mL 无菌水反复冲洗若干遍回收最后一次冲洗液取适量涂布至平板培养基以检测表面消毒效果1.2.2 太岁样品中菌株的分离 用灭菌的解剖刀将表面消毒完全的太岁样品切割成约 1 cm×1 cm 小块将切好的样品放入灭菌的研钵中用研磨棒将样品磨碎向其中加入无菌生理盐水 150 μL将上清全部吸出涂布于无抗麦芽汁平板30恒温培养箱倒置培养 3 d1.3 太岁及分离菌株的鉴定1.3.1 样品总 DNA 提取 将太岁样品切成小块状在无菌条件下磨碎100煮沸 10 min使其基因组完全释放以此为模板进行 PCR 反应1.3.2 16S rDNA18S rDNAITS 序 列 的 扩 增 1由北京六合华大生物技术有限公司合成PCR 扩增体系10×缓冲液 5 μLdNTP 4 μL游引物各 2 μL模板 1 μLTaq 1 μLddH2O 50 μL16S rDNA PCR 扩 增 条 件 9510 min9530 s5030 s7290 s30 个 循 环 7210 min18S rDNA ITS 扩增条件9510 min9530 s5530 s7290 s30 个 循 环 7210 min1.3.3 太 岁 样 品 及 其 分 离 菌 株 的 16S rDNA18SrDNAITS 测序 PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电切胶回收目的条带将回收产物与 pMD18T 载体连接16过夜转入大肠杆菌 DH5α感受态涂布X-Gal 平板37倒置培养 12 h 后挑取白斑培养菌液 PCR 鉴定阳性克隆将阳性转化子测序北京六合华大基因科技股份公司完成),将测得的基因序列GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对定与所得菌株同源性最高的种属表1.png

2 结果2.1 菌种的分离从太岁 1 号样品中分离得到 6 株可培养的单菌经 菌 落 形 态 观 察 确 定 为 3 种 微 生 物 编 号 为T1-1T1-2 T1-3从太岁 2 号样品中分离得到可培养的单菌落 10 通过菌落形态观察确定为 3 微生物编号为 T2-1T2-2 T2-32.2 太岁样品及其分离菌株的分子生物学鉴定2.2.1 太岁样品的分子生物学鉴定 通过对太岁12 号样品的 16S rDNA18S rDNAITS 通用引物扩增序列测序将所得序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对结果表明太岁 1 号样品中包含 葡 萄 球 菌 属Staphylococcus)、白 色 侧 齿 霉 菌Engyodontium album)、假丝酵母属Candida),太岁2 号样品中包含粘质红酵母Rhodotorula mucilaginosa)、南极真菌Antarctic fungal)、锁掷酵母属Sporidiobolales)。2.2.2 太岁分离菌株的分子生物学鉴定 对太岁中分离到的菌株的 16S rDNA18S rDNAITS 序列测将所得序列与 GenBank 数据库中的已知序列进Blast 比对表明太岁 1 号样品中分离到的 T1-1 属于假丝酵母属T1-2 T1-3 粘质红酵母2 号样品中分离到的 T2-1 T2-2 为根癌农杆菌T2-3 为粘质红酵母2 个太岁样品的分离菌株中都发现了粘质红酵母且太岁 2 号样品比对结果也表明其中存在粘质红酵母2.2.3 太 岁 中 分 离 的 3 株 粘 质 红 酵 母 初 步 研 究Blast 结果表明太岁 12 号样品中均分离到粘质红酵根据 Blast 结果以及对 3 株菌株的形态观察现这 3 株菌无论是在序列还是形态上均存在很大差21)。表2.png

讨论太岁是自然界中存在的一种身份未明的生命目前对于太岁的身份主要有以下几种观点一种说法认为太岁是一种特大型罕见的黏菌复合体一种说法认为太岁主要由粘细菌构成还有一种说法是太岁为一种特殊的高等真菌另有人提出太岁并非黏菌群复合体我们试图从微生物学角度研究太岁的菌种组希望能分离培养到样品中的优势菌株对太岁的生物多样性有一个初步的了解我们采用传统的菌种分离方法从 2 个太岁样品中各分离得到 3 种形态不同的菌株通过分子生物学技术对 2 个太岁样品及分离菌株的 16S rDNA18S rDNAITS 序列进行扩增将所得序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行 Blast 比对发现从太岁 1 号样品中分离到 2 粘质红酵母和 1 株假丝酵母属的菌株2 号样品中分离到 2 株根癌农杆菌和 1 株粘质红酵母1 2 号样品中均分离到粘质红酵母初步断定粘质红酵母是太岁可能的优势微生物类群之一这对未来太岁身份及组成的研究有所帮助由 于 条 件 所 限 本 研 究 还 存 在 很 多 局 限 和 不首先太岁样品的数量较少提供太岁样品的收藏者对太岁的天然来源没有明确记载有待大量收集样品并确定其最初产地以便分析样品中微生物种群组成与地域之间的关系有些从形态上看似比较老龄组织体质地比较致密的太岁样品往往组织体的微生物形态不清晰较难分离到存活的微生物可能其中大部分微生物已死亡其次没有一个合适 的 基 因 组 提 取 方 法 来 保 证 回 收 到 所 有 的 DNAPCR 的引物也是影响实验结果的一个重要方面文献报道[5]在引物设计方面存在的一些问题导致引物扩增具有一定的偏向性经多轮扩增后会产生很多误差从而导致实验结果的偏差[6-7]图1.png

志谢央视科技频道耿卓娅女士太岁收藏者朱跃峰刘志军才彦良提供了太岁样品特此致谢参考文献[1] 宋素琴, 欧提库尔·玛合木提, 张志东, . 新疆胀果甘草内生菌的分离和鉴定[J]. 微生物学通报, 2007,34(5):867-871. [2] 周涛, 肖亚中, 李妍妍, . 茜草内生菌的分离鉴定及其抗菌活性物质研究[J]. 生物学杂志, 2007,24(2):9-12. [3] 何毅婷, 杨汝德, 张广, . 18S rDNA 序列鉴定一株产纤维素酶真菌[J]. 现代食品科技, 2008,24(7):638-640. [4] 戴璐, 董兆麟大型黏菌复合体黏菌和真菌多样性的初步研究[D]. 西安: 西北大学生命科学院, 2007. [5] Smit E, Leeglang P, Glandorf B, et al. Analysis of fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of clonedPCR-amplified genes encoding 18S rRNA and temperaturegradient gel electrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 1999,65:2614-2621. [6] Zheng D, Alm E W, Stahl D A, et al. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies[J]. Appl Environ Microbiol, 1996,62:4504-4513. [7] Suzuki M T, Giovannoni S J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes byPCR[J].App

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