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”太岁大型黏菌复合体”黏菌和真菌多样性

来源:西北大学学位论文作者:戴璐网址:http://www.csbly.com浏览数:107 
文章附图

类号: 单位代码:10697

号:200420815

硕士学位论文

题目:大型黏菌复合体”黏菌和真菌多样性 的初步研究

作者:戴璐

指导教师:董兆麟专业技术职务:教授

学科(专业):应用微生物学

答辩日期:2007.06学位授予日期:

二零零七年五月

硕士学位论文

Thesis for master degree

“大型黏菌复合体”黏菌和真菌多样性的初步研究

Assessment of myxomycete and fungal diversity of

the "myxomycete comp I ex?,

西北大学生命科学学院

西安710069 2007. 4

Col lege of Life Science , Northwest University

Xi'an 710069 Apr. 2007

西北大学学位论文知识产权声明书

本人完全了解学校有关保护知识产权的规定,艮卩:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时,本人保证,毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。

西北图一.png

I

ABSTRACT :II

第一章综述1

1 "大型黏菌复合体"概况1

1.1关于“不明生物体”的发现的新闻报道1

1.2民间关于“不明生物体”的观点2

1.3本文对“不明生物体”的研究出发点3

2黏菌研究概况4

2.1黏菌的研究历史和分类4

2.2黏菌的分布5

2.3黏菌生物学研究概况6

2.4黏菌研究其他方面的进展12

2.5国内黏菌研究进展13

3真菌多样性的研究概况13

3.1核酸杂交14

3.2克隆文库核酸序列分析15

3.3 DNA指纹图谱分析16

4本实验的研究目的和内容19

第二章“大型黏菌复合体”黏菌的分离与鉴定21

1材料与方法21

1.1 “大型黏菌复合体”样品简介   21

1.2样品的采集21

1.3培养基21

1.4主要实验仪器22

1.5黏菌的分离22

1.6原质团的纯化和子实体的诱导形成22

1.7黏菌的鉴定22

2结果与讨论23

第三章“大型黏菌复合体"真菌多样性的初步调查26

第一部分平板培养方法研究其菌多样性28

1材料与方法28

2.结果与分析31

第二部分克隆文库序列分析法调查真菌多样性37

1 .材料与方法37

2结果与分析42

第三部分T-RFLP方法调查“大型黏菌复合体”真菌多样性45

1材料与方法46

2结果和讨论48

本章小结及讨论50

结论53

参考文献54

附录一缩略词表63

附录二黏菌照片64

附录三真菌测序和ALIGNMENT结果64

附录四6个己知菌株和样品的基因扫描图谱64


据报道,近年来我国多处在河滩发现或从地下挖出肉团状民间一般称为“太岁”的 所谓“不明生物体”。这类“不明生物体”曾被鉴定为“大型黏菌复合体”,但至今未见 相关的系统研究的论文发表,所以目前这类“不明生物体”并没有一个科学的定义,本文传承了“大型黏菌复合体”这一名词,只是为了便于称呼,并不以“大型黏菌复合体” 作为本实验研究的前提和结论,也不受其他民间报道的影响。研究样品取自西北大学生 科院标本室所收藏的花圃中发现的“大型黏菌复合体”。实验中将其作为微生物生态学 研究中的环境样品处理,从微生物生态学角度,调查分析了它的黏菌构成和真菌多样性, 为以后进一步探明“大型黏菌复合体”的化学成分和形成原因打下基础。本文由两部分 组成:

1利用玉米琼脂和燕麦琼脂的有饲培养技术初步从“大型黏菌复合体”中分离纯 化出了2种黏菌,以实体解剖镜、光学显微镜和环境扫描电镜观察原质团和子实体的形态和结构,将这2种黏菌分别鉴定为疣泡钙皮菌(.Didymium verrucosporum)和扁垫双 皮菌(Diderma deplanatum )

2结合3种技术即传统的平板培养方法、克隆文库序列分析和T-RFLP方法调查T “大型黏菌复合体”真菌的多样性。初步得知“大型黏菌复合体”的真菌构成包括枝 顶泡霉属、青霉属、曲霉属、木霉属、丛赤壳属、赤霉属、枝他属、葡萄状穗霉属、石 座菌属和帚枝霉属。其中枝顶泡霉属、木霉属和青霉属占优势,且TRFs显示“大型黏菌复合体”至少有18个类群的真菌。

综上所述,本研究初步描述了“大型黏菌复合体”的黏菌构成和真菌类群,有助于 进一步探明“大型黏菌复合体”的形成原因。在下一阶段工作中,将深入研究“大型黏菌复合体”的化学成分和微生物群体的代谢产物来探讨其可能的形成原因。

关键词:“大型黏菌复合体”;黏菌构成;真菌多样性;ITS区;T-RFLP


Assessment of myxomycete and fungal
diversity of the “myxomycete complex75

abstract

It is reported that many so-called ''unidentified organisms” named Tai sui” were discovered on river banks and from the soil in China these years.These ''unidentified organisms” were identified as Myxomycete complex”but no thesis on this subject has been published yet. Therefore, there is no scientific definition on these ''unidentified organisms". The term “myxomycete complex,^ is still used in this paper , but not as the implicit precondition or conclusion of the study, just for the convenience of appellation . The sample studied in this paper is the collection from the garden of Northwest University. And myxomycete complex" is treated as environmental sample of microbial ecology studies to assess its myxomycete components and the fungal diversity . There are two parts in this study as following.

1 20 strains of myxomycetes have been isolated from the amyxomycete-like complex” using com meal-agar and oat meal-agar culture techniques. The morphological characters of the strains are described with light microscope(LM) and the microstructures of sporangium are presented by scanning electron microscopy(SEM). The identification shows there are 2 species, Didymium verrucosporum and Diderma deplanatum.

2 The fungal diversity of ^myxomycete complex" is assessed with 3 combined technologies, the traditional culture method, the sequencing of clone library sequences and T-RFLP. The results indicates that there are Acremonium, Trichodenna, Aspergillus, Penicillium, Nectria, Gibberella, Cladosporium^ Stachybotrys, Petromyces and Sarocladium in the sample, and Acretnonium, Trichoderma, Penicillium are dominating ones.TRF pattern shows at least 18 OTUs in the sample.

In summary, myxomycete components and the fungal diversity described in this study give a clue to the possible formation reason of myxomycete complex". Detection of chemical


components of <4myxomycete complex,, and analyses of the metabolism products of the microbial community will be involved in the further study.

Key words "myxomycete complex,,; myxomycete components; fungal diversity; ITS region; T-RFLP

in

第一章综述

1 “大型黏菌复合体”概况

1.1关于“不明生物体"的发现的新闻报道

近年来,我国多处在河滩发现或从地下挖出肉团状所谓“不明生物体”。现将相关 主要新闻报道罗列如下:

(1) 发现时间:198612

发现地点:甘肃永登县十米深的地下

特征描述:光滑、上白下黄、似坛子一般的,直径14厘米、高17厘米。

(新华社)

(2) 发现时间:1992822

发现地点:陕西周至县渭河滩

特征描述:肉团长75厘米、宽52厘米、周长110厘米,通体褐色,内部肌体颜色纯白,有明显分层,手感柔软。(羊城晚报)

(3) 发现时间:1999

发现地点:内蒙古呼和浩特市

特征描述:重4.85公斤,顶部直径0.25米,分布着放射状褶皱,高0.12米,拦腰周长0.67米。侧面观察,能够分辨出一圈一圈的纹理,像是生长年轮。底部直径近0.19米,灰黑色。除最底部约0.02米厚的地方为红褐色外,其它地方均为浅黄色,整体韧性很大, 掰不动也撕不开,似牛皮筋。(羊城晚报)

(4) 发现时间:2004

发现地点:内蒙古巴彦淖尔市临河区乌兰图克镇红旗村

特征描述:手感和肉一样;夏天不会因气温高而腐烂,冬天也不会因温度低而僵硬:它身上的“伤口”能够自动愈合;它无异味且在不断地长大。长约52厘米、宽约40厘米、厚约20厘米。(羊城晚报)


5)发现时间:2005

发现地点:沈阳新城子区清水台

特点:黑乎'F软绵绵的就像海绵。(羊城晚报)

1.2民间关于“不明生物体"的观点

以上报道都称,"不明生物体”多数长在土里,形状不规则,像团肉,久放不腐不 臭,有人还观察到生长,但观察不到细胞结构,故人们将其称为“不明生物体”。民 间一般将之称为“太岁二我国古代书籍中有很多关于太岁的记载,《本草纲日》称其为“肉芝"、"视肉"、“土肉”、"聚肉"、"封"等。

“不明生物体”究竟是什么仍然众说纷纭。由于未见关于此物系统研究的论文发表, 现将民间及新闻报道的主要观点总结如下:

1“大型黏菌复合体

1992822 B陕西周至县渭河滩发现的样品在陕西省及西安市科委的策划下, 由西北大学生物系组织了生理、动物、植物、细胞、微生物、真菌、医药等方面的13 位专家教授进行了分析研究。研究报告认为,此生物体是在秦岭山中生长,因山洪暴发冲入渭河,被人发现捞起。专家们在“不明生物体”的实验研究报告中将其命名为“特大 型罕见粘菌复合体气

2)并非黏菌复合体

中科院微生物所形态学专家邱晓岚研究发现:该物体体内含大量的水;火烧,有呛鼻气味,估计有醛基、醇基或羟基成分;没有蛋白质反应,也没有核酸反应。中国科学院微生物研究所研究员郭英兰把号称是太岁的东西进行切片,在显微镜下观察,却看不到任何细胞结构,也未见真菌的菌丝或者弛子这类结构。

3)高等真菌

南开大学生命科学学院白玉华教授将”太岁”切片后放在显微镜下观察,发现其体内 具有菌丝,初步确定为高等真菌。

<4)难以给这个生物冠名

中科院广州微生物研究所研究员李泰辉表示,虽然“太岁”为黏菌群复合体的说法基本可以认定,但关于“黏菌群复合体”这一概念是非常模糊的,还不能清楚解释“太岁” 为何种物种,惟有通过分子系统分析,才能将“太岁”身上的秘密一一揭开。全球的科学家对于菌类的研究还非常有限,目前存在于自然界的包括黏菌在内的真菌大约在150-200万种,科学界大约只对其中5%的种有研究,因此科学界依然还难以给这个复杂的生物正式冠名。

1.3本文对“不明生物体”的研究出发点

因为目前对这类“不明生物体”并没有一个科学的定义,本文传承了 “大型黏菌复合体”这一名词,只是为了便于称呼,并不暗示“大型黏菌复合体”是本实验研究的 前提和结论,也不会受其他民间报道观点的影响。本文的研究样品取自本院标本室所收 藏的花圃中发现的与以上报道相似的“不明生物体”。在实验中将此样品当作微生物生 态学研究中的环境样品处理,试图从微生物生态学角度,调查分析它的黏菌构成和真菌 多样性。


2黏菌研究概况

本文所提及的黏菌均为真黏博。真黏菌(true slime moulds)是一类特别的原生动物, 可能是最低等的口<核生物之-1。又称为原质团黏菌(plasmodial slime moulds)IE细胞黏菌(myxomycetes)o表现为以下生活循环的各个阶段:(1) 3种类型的单细胞,底中之一是有鞭毛(flagellum)的。(2)营养体阶段是被称为原质团(plasmodium)的多核结构,可吞食、移动,且原生质表现出往复流动(reversible shuttle streaming)□ (3)抗不良环境的菌核(sclerotium)阶段。(4)从营养体阶段转入繁殖阶段时,原质团转变为一个或一群非细胞结构固定的子实体(fruitingbody),子实体内含具壁的泡子(spore) ⑴。从以上可知,粘菌生活史同时具有动物性和菌物性,即其营养期二倍体阶段为变形 虫形无细胞壁的多核原生质团,无叶绿素,非光合营养,以吞噬方式摄食,是动物性的;

)

但生殖时由原质团发育分化成子实体,产生抱子,泡子为经历了减数分裂之后的单倍体, 具有纤维素壁,这又是菌物性的⑵。黏菌的数量很少,鲜为人知,全世界大约有600⑴,而我国报道约400种囹。己知可在培养环境下完成生活循环的种类不多,即使是已有文献研究的品种,其培养方法仍不是每次都可成功⑶。由于黏菌很难在实验室完成 整个生活史和仍没有发现巨大的经济价值等原因,目前世界对黏菌的研究相比于其他微 生物还处于较低水平,一般是对野外采集的子实体进行形态发育的观察研究,利用分子 技术研究的只有较易培养的少数几个种”"I】。鉴定也只能依靠对子实体外部形态和扫描电镜对他子、泡丝、钙质结晶等细微结构的观察描述进行。

2.1黏菌的研究历史和分类

黏菌的研究历史从Pankow1654年发表的被公认是第一篇关于粉瘤菌(Lycogala epidendrum)的描述开始。Anton de Bary (1858. 1859, 1887)首次提供了有关这一类群详细生活史的研究结果。1911List最早培养了黏菌由于黏菌特殊的结构与生活习性,长期以来关于黏菌的分类在菌物学界有许多争议。菌物学家GW.Martin (1932, I960)为真黏菌的歯物属性进行了强有力的辩证,他和许多菌物学家把这类生物与菌物归为一类。另一方面,根据真黏菌形成原质团,de Bary (1887)将其包括在菌虫门(Mycetozoa)中,认为真黏菌与菌物没有关系,而与原生动物具有密切关系,这一观


点也为其他生物学家如Bessey (1950)Kudo (1954)Olive (1970)所接受。随着生物科学的发展,除了来自生活史研究和电子显微镜(特别是鞭毛阶段)的丰富的形态学 证据和有关原生生物更为全面性的知识外,来自分子生物学的新证据基于rRNA基因的小亚基序列分析的系统发育树也佐证了de Bary的观点冋。Hawksworth等在Dictionary of the Fungi中将黏菌归于原生动物界|3]. Alexopoulos等在Introductory Mycology中将真黏菌立为黏菌门(Phylum Myxo/nycofa),与网柄菌门(Dictyosteliomycota)集胞菌门CAcrasiomycota)和根肿菌门(PlasmocUophoromycota)同属于原生动物(Protist)⑵。 现今,人们已经广泛接受将真黏菌置于菌物界之外而划入原生动物的观点。

Alexopoulos⑵认为黏菌门(Myxo/nycofa)仅含有--个纲一黏菌纲,这个纲被分为3 个亚纲,共含有6个目:无丝菌目(Liceales)刺轴菌目(Echinosteliales)团毛菌目(Trichiales )、绒泡菌目(Physarales )、发网菌目(Stemonitales )和鹅绒菌目 CCeratiomyxales).它们的划分基于抱子果的发育方式、砲子体的类型、泡子产生方式、泡子颜色、泡丝有无钙质以及原质团类型。

2.2黏菌的分布

黏菌是一个世界性普遍分布的类群,几乎可以在各种不同的生境中发现,不过,一般最可能发现黏菌的地方是潮湿的温带森林,在那里,黏菌发生在腐木、枯叶和其他有机质上;此外,在热带森林、草原、高海拔山地、北极、南极以及沙漠也都能找到黏菌。虽然有些种分布非常广泛,但一些种似乎仅限于某种生境。例如,有些种又似乎适应沙漠环境。有少数几种黏菌长期被认为来自仙人掌上(Evensen, 1962 Martin and Alexopoulos, 1969),只是到80年代,才获得沙漠黏菌普遍存在的评价(Blackwell and Gilbertson, 1984)o FeestMadelin (1985)发现在土壤中有大量的原质团形成单位(可 能是抱子和小胞囊)。黏菌在食草动物粪便上也很常见,但可被限定于以食草动物粪便 为生活基质的仅有少数几种。

其实黏菌生长的基物是次要的,因为黏菌吞噬这些基物上的菌物、细菌和原生动物等微小有机体而不是基物本身来维持营养体的生长。湿度和温度也是重要的因素,影响一些种的定期出现和季节发生特点。在北温带的雨季,黏菌从5月开始出现,直到10 月末连续地产生砲子。但并非所有的种随时都能见到,有些种春季较多,有些在仲夏,曲些在初秋卩气

虽然黏関并不具有直接的经济重要性,但对细胞学家、遗传学家、分于生物学家、生物化学家和车物物理学家来说是有价值的实验生物0它们是研究有丝分裂环、形态发牛、制约繁她的化学变化、原圭质的结构生理学和运动、衰老的理想的实验工具。用于绝大数研究的种是常见的多头绒泡菌(P/zysars polycephalum),威斯康星大学麦卡德 尔癌症研究实验室(McArdle Laboratory for Cancer Research. University of Wisconsin) 广泛研究了它的细胞循环。

2.3黏菌生物学研究概况

1描绘了黏菌的典型生活史,以下讨论生活史中的各种结构和主要环节。

2.3.1弛子萌发、黏变形体和游动细胞

O

自然条件下,黏菌抱子可能在雨水与落有徳子的基质形成的稀溶液中萌发。匏子萌发后产生黏变形体(myxamoebae)还是游动细胞(swarm cells)取决于环境条件,Gilbert1'41 Smith^l分别报道了一般萌发时(图1-B)释放出1-4个单核的原原生质体(protoplasts),较干燥环境下,形成无鞭毛的黏变形体(nonflagellated myxamoebae)(1-0,如果水份充足,一般形成有鞭毛的游动细胞(flagellated swarm cells)(图1-Ci), 但有时释放出的为变形体,先保持静止几分钟,然后发育出鞭毛成为游动细胞。Alexopoulos図指出游动细胞具1-4根前生鞭毛,这些鞭毛均为光鞭型。游动细胞本身不能分裂,然而,它们很容易在缩回其鞭毛后转变成黏变形体。游动细胞通过从周围环境中吸收已溶解的营养物质,并在其后端用假足卷取和吞食细菌、酵母、某些有机物颗粒,甚至在一些情况下以某些类型的菌物砲子为营养。在活动一段时间后,游动细胞收回其鞭毛而转变成黏变形体。像游动细胞-样,黏变形体也能伸出假足摄取食物颗粒。当食 物丰富且环境条件适宜时,黏变形体连续分裂,产生一大群细胞。在不良条件下,黏变 形体会变圆并分泌出一个半乳糖胺的壁,形成小胞囊。当恢复适宜的条件时,小胞囊萌 发,形成黏变形体或游动细胞。

西北二.png

Figure 1 Life cycle of the typical heterothallic myxomycete [Drawn by R.W.Scheetz]

(A)a mature haploid spore, (B) a burgeoning spore, (C) myxamoebae, (Cl)swarm cells, (D) syncretic

myxamoebae, (DI) syncretic swarm cells (E) young zygote, (F)young plasmodium» (G)mature

plasmodium, (H) sclerotium» (I)the forming of spores. (J) mature sporangium after meiosis.


2.3.2原质团的形成、原生质流和原质团的迁移

/F.异宗配合的株系中,游动细胞和黏变形体行使配子功能,它们最后成对(两个游 动细胞、两个黏变形体,或者可能是一个黏变形体和-个游动细胞)融合形成合子 (zygote)(图1-D, Dp E )。这种合子最初是有鞭毛的,游动一段时间后缩回鞭毛成 为变形体状细胞,随着合子的生长,其核进彳「连续的有丝分裂但没有紧随的胞质分裂, 细胞转变成多核的变形体结构-原质团(plasmodium)

原质团是一个合胞体,即几百万个核共有一个细胞质,仅为一层纤薄的原生质膜和一个胶质鞘所包围,没有明确的大小和形状,有时是扁平状的、扩展成大面积的稀薄并具有鲜艳颜色的网体,不断地变形、流动,爬行在基物表面,一路吞食食物颗粒。原质团常被描述为一•团裸露的原生质,从它没有细胞壁的角度上,这一描述是正确的,但大 多数种的原质团包有一层胶黏质的鞘,鞘含有微纤丝。紧邻鞘内侧的是原生质膜,包围 并封闭着细胞质。存在于典型真核细胞中的各种细胞器也存在于原生质中。在显微镜下 可观察到原质团网脉(veins)中的原生质流动现象。如果把低倍镜对着生长旺盛的原质团中的一条网脉,就能看见原生质颗粒快速地向一个方向流动,几十秒后,流动慢下来, 短暂停顿后,然后开始向相反方向流动。Kamiya1161利用摄影技术对原生质流的速度进行了定量描述。Ashworth⑴认为原生质的往返节律流动与原质团质膜内侧的外质层的肌 动蛋白丝有关。

原质团可在基物或培养基上迁移,可能这一反应会使原质团接触到新的摄食区域。Natsume"Smith四认为原质团的运动行为受化学物质的影响,发现细胞质中Ca2+的 波动驱动了迁移运动。

原质团颜色多样,有无色的、白色、灰色、黑色、紫色、蓝色、绿色、黄色、橙色和红色,但最常见的可能是黄色和白色的。大多数原质团色素的化学性质还未被阐明。在自然情况下,原质团可能取食细菌、菌物的胞子和植物,也可能取食原生动物甚至小块的非活体的有机物,它们也常包围并部分摄食层孔菌和蘑菇的子实体。在实验室内,有些种的原质团能在研磨得很细的燕麦粉或燕麦培养基(oatmeal medium)上生长。原质团有3种基本类型:原始型原质团(Protoplasmodium )、隐性原质团(Aphanoplasmodium)和显型原质团(Phaneroplasmodium)(表 1)㈣。

西北三.png

2.3.3菌核的形成

正常发育过程中,原质团产生泡子体。不良条件下,一个显性原质团会转变为一个坚硬的不规则团块,即菌核(图1-H)菌核能长期处于休眠状态,当条件适宜时,又可恢复生长为原质团【2%

2.3.4子实体的形成

在从营养阶段转入繁殖阶段时(图1-1, J),黏菌的整个原质团转变成一个或多个子实体。原质团形成子实体是不可逆的。诱导子实体形成的各种因素包括湿度、温度、饥


饿和光照。Hosoda"发现当原质团刚处于伉饿状态时具有最大的产泡能力,用光照射2 天可诱导形成『实体。若饥饿超过3天,则产饱能力呈.线性下降。原质团必须有足够的 尺寸才能产抱。小原质团无论在黑暗中饥饿多久都不形成子实体,而形成菌核。

黏菌的抱子有外生的和内生的,除鹅绒菌目中鹅绒菌属的3个已知种外,其他全部黏菌都是砲子内生的,即子实体被一种称为包被的非细胞覆盖物所包被。抱子内生的抱子器叫抱囊(sporangium),是分类重要的依据。抱囊有4种基本类型:分开的抱囊、复囊体(Aethalium)假复囊体(pseudoaethalium)联囊体(plasmodiocarp)(表 2)。泡囊或其他类型的弛子体典型地由下列部分组成(表3):基质层(hypothallus)泡囊柄、泡囊被(peridium)囊轴(columella)和假囊轴(pseudocolumella)弛幺幺(capillitum) 和假泡丝(pseudocapillitum)石灰质、弛子,但并非所有泡囊都具有这些部分。例如,基质层可能显著或不显著,甚至不存在;许多泡囊无柄;有无囊轴和泡丝或假囊轴和假泡丝。所有这些结构的有无或特征都是黏菌分类的依据。

2黏菌的4种形囊类型[48]

Table 2 4 types of sporangium of myxomycetes

西北四.png西北五.png

EF2.4黏菌研究其他方面的进展

2.4.1黏菌分类学

近年来,黏菌分类学研究非常活跃。如1999年,Matsumoto等罔发现了钙皮属的2 个新种Didymium laccatipes Didyium angularisporum o 1999 Lado 等卩小和2003 Mosquera等㈣分别从来自西班牙Canary岛、墨西哥和美国的腐烂的肉质植物材料发现并培养了新种Licea succulenticola Cribraria zonatispora« 2001 Estrada-Torres 等心) 从半干早地区墨西哥的Siena de Huautla自然保护区发现了2个新种Cribraria fragilis sp.o初和Diderma acanthosporum sp.nov.» 2004 Keller㈣等在美国的Great Smoky Mountains国家森林公园的树冠生物多样性调查中观察到一种新黏歯Diachea frboricola.a

2.4.2黏菌分子生物学

目前利用分子技术研究的只有较易培养的少数几个种。OtsukaW]最先测出了多头绒泡菌的5.8S26S rRNA基因,这是黏菌分子系统学研究的里程碑。Johansen^^测出了多头绒泡菌19S rDNA的全部序列和黄柄钙皮菌的rRNA的大亚基序列。1995Rusk 等为扩增黏菌核糖体小亚基DNA设计了引物O 2003Martin等区】设计了扩增黏菌ITS区的引物。

2.4.3黏菌开发利用研究进展

因为黏菌难培养及子实体很小,难以收集到足够的量进行代谢产物的化学成分分析,对于黏菌产物的开发利用只处于起步阶段。1992年巴西的Pereira等人报道了2种粘菌Fuligo sepca(L.)Wigg Tubifera /ncmspe/7na(Berk.andcurt)Martin 的粗提物抗南和细胞毒性活性研究结果,指出F. septica提取物对枯草杆菌和白色念珠菌具有明显抑制作用,T. microsperma的甲酸提取物具有抗金黄葡萄球菌、耻垢分枝杆菌、白色念珠菌等活性作用,Eseptica丙酮提取物对KB细胞有明显的毒性。1995年德国Wolfgang对粘菌Ceratio myxafracticutosa中的不饱和6-烷基毗喃酮进行了分离提纯。2003年日本千叶大学的石桥正己等报道了从扁凹钙皮菌(Didymium bahiense var. bahiense')的实验室培养物分离提取出固醇类、一种新型具有抗菌性的甘油酯和色素pyrroloiminoquinone132-33|o 2004朱鹤应用气相色谱法、质谱法对团毛菌目黏菌中的脂溶性化学成分进行了分析,确定其中含有磷酸三丁基酯、2一甲基丁二酸二异丁基酯、邻苯二甲酸二丁基酯、十七碳烷, 这些成分均在黏菌中首次发现。其中磷酸酯对某些磷酸酶有抑制活性,为酶自杀性抑制 剂,对某些癌具有抑制活性,这一活性物质的发现对粘菌的开发具有重要意义。

2.5国内黏菌研究进展

我国黏菌研究起步较晚。邓书群是第一位报告中国黏菌的中国学者,他在其专著《中国的真菌》列出了30个属共142个种的检索表【35】。周宗璜和李玉作为中国学者发表了第一个黏菌新种一无节筛菌俄1。王琦对中国团毛菌目粘菌进行了系统研究"I。陈双林对中国绒泡菌属的系统分类和发网菌目的分类学做出了研究"39】;高文臣㈣研究了东北钙皮菌科的分类。刘淑艳的黏菌的一些主要分类单元19srDNA序列测定及其分子系统学的研究1糾是我国黏菌分子生物学的开创性工作。2000年用RADP研究了黏菌粉瘤菌属内3个种的分子系统学关系“% 2003年对大粉瘤菌Lycogala flavofuscum19S rDNA 片段进行了克隆测序1104112004年首次扩增了首次用PCR法扩得长尖团毛菌小亚基rDNA片段HR与黏菌分类学相比,我国的黏菌生物学才刚刚起步。利用湿室培养的方法陈双林等人得到18种黏菌。陈双林等HR描述了所获得的原质团的类型、原生质流,以及转变成子实体过程和子实体的类型。王琦【的对团毛菌目黏菌中的主要属种的个体发育进行了初步的研究。

综上所述,黏菌的研究已经取得了很多成果.,特别是黏菌生物学、分类学和分子生物学等方面,但近10年来国际取得的研究进展比较少。中国的黏菌研究在分类学、分子生物学和生态学等方面处于世界先进水平,但国内黏菌生物学的研究刚刚起步。

3真菌多样性的研究概况

真菌(Fungi)为具有真核,能产生抱子、无叶绿素的有机体,以吸收方式获得营养,普遍以有性和无性两种方式进行繁殖,菌纟幺.通常是由丝状、分枝的枝细胞构成, 并典型地被细胞壁所包裹。真正意义的真歯(Fungi)包括壶菌门(Chytridiomycota)接合菌门(Zygomycota),子囊菌门(/Iscomycofa)和担子菌门(Basidiomycota)⑵。 Hawksworth145'46471指出自然界中约有150万种真菌,但至今被正式描述的种类只有0.7%,其原因是缺少对群落中所有真菌都适应的培养基和培养条件,大量真菌无法被分离培养。在真菌多样性研究中,因为现实中的许多真菌菌丝体在环境样品中处于休眠或不活动状态,传统纯培养技术和显微镜观察方法已经不能满足研究的需要,很难得到大多数种类的信息卩叫近几年来,运用分子生物学技术研究环境样品的真菌多样性,使人们可以避开传统的分离培养过程,直接从环境样品中提取DNA,通过分析DNA序列同源性、片段多态性来确定环境样品中真菌的种类和数量。聚合酶链式反应(PCR)技术及以此为基础的核酸杂交、序列分析、DNA指纹图谱分析,如限制性片段长度多态性(RFLP)末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)随机扩增片段多态性(RAPD)变性梯度凝胶电泳(DGGE)温度梯度凝胶电泳技术(TGGE)单链构象多态性(SSCP)等技术为真菌多样性和群落结构研究提供了新的方法"I现将几种主要方法介绍如下。

3.1核酸杂交

杂交方法被用来估计不同真菌种类基因组间总的相似性或检测环境样品中真菌的特殊核酸序列。核酸杂交的理论基础是DNA变性与复性动力学原理,即具有一定同源性2条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等),可按碱基互补原则退火形 成双链。核酸分子杂交的序列同源性主要以杂交百分率和杂交复合体的热稳定性来衡 量。两种生物之间的亲缘关系越近,它们之间所共有的多核昔酸相同序列就越多,即同源 百分率越高伽八用整个基因组进行的核酸分子杂交,除近似种以外,其余的序列同源性 都较低。因此基因组杂交用于亲缘关系较近的种或种内不同分离物之间的鉴定。 Baharaeen151'521等曾经用互补序列DNA25S rRNA进行杂交研究担子菌和酵母之间的关系。但是核酸杂交方法也具有一定的局限性,有时亲缘关系较近的种类核酸杂交的同源百分率很低,亲缘关系较远的种类之间核酸杂交的百分率却很高I削。总之,核酸杂交技术适于鉴定和定量环境微生物群落中特定分类单位(域、属、种、亚种)的微生物,也可 监测特定种群或种类的变化,但不适于描述群落结构和总体多样性,因为实际中使用的 探针种类或引物的套数是有限的031

3.2克隆文库核酸序列分析

确定环境样品中存在的真菌种类以及各类真菌间关系的最有效方法是克隆文库核酸序列分析。克隆文库分析法是将PCR扩增的环境微生物样品总DNArDNA (核糖DNA)片段(或其它标记基因)克隆进合适的载体,构建克隆文库以分离不同的序列,然后对分离的序列釆用测序技术进行定性分析。对于测得的序列,可以通过与NCBI 数据库中已有数据的对比鉴定其分类地位,许多序列可以鉴定到种的水平I%'通过分析rDNA片段的类型和出现频率,可以得到微生物群落结构和多样性的信息"I运用该方法的首要问题是确定所要分析测定的rDNA片段。5.8SrDNA由于核昔酸序列短、高度保守,很少用于真菌的系统发育和分子鉴定。18SrDNA的片段较长(约为1800bp),段中存在保守区和可变区,选择不同的特异扩增引物将某一结构域扩增测序,可用于真菌目、科、属等分类阶元的研究。在壶菌、接合菌、子囊菌和担子菌中己经测定了一些菌株的18S rDNA的部分或完整序列,验证了传统的分类系统〔岡。28S rDNA不同的结构域比18S rDNA有更大的变异,选择某一变异较大的结构域进行研究对真菌的系统发育研究具有重要意义,如Guadet-可对镰刀菌F„踱乃“四)的研究。目前最受注目的是 5.8S rDNA及其两端的ITS(intemally transcribed space)序列,因为其进化速度快而主要用于研究低级分类单元的关系,如Lee〔明对疫霉属种间关系的研究,Gardes等网对蜡蘑属Laccaria) 4个种的研究,以及Skouboe等例对青霉属(Penicillium) 的研究。釆用克隆与测序的方法对环境样品中的真菌进行分析,能够提供关于各个克隆分类地位的可靠的信息,但需要很长的试验周期、大量的试验材料,实际工作中对所有的克隆进行测序难以实现,通常需要与RFLP法或T-RFLP法结合,或者只随机挑选部分克隆进行测序,而且根据克隆的拷贝数估计种群丰度将导入随机误差。通过指纹分析获得的真菌基因序列准确性不如克隆,但DNA指纹分析方法更为简便,快速,尤其适合于环境或样品中真菌群落的差异比较

3.3 DNA指纹图谱分析

DNA指纹图漕分析技术以DNA作为信号分子,通过分析其在种内水平或种群水平上的变化来鉴定各种生态系统中的真爾数量与种类。目前,常用的信号分子是rRNA基因的序列和ITS(intemal transcribed spacer), IGS (intergenic spacer)区域。通过分析可以推测真菌种间亲缘关系的远近从而确定真菌的系统发生关系。ITS区域分析己经成功的用于描述土壤真菌的群落结构[13]0与传统的培养方法相比,ITS区域分析能获得真菌群落结构的更详细认识。群落总DNA指纹图谱分析的通用技术路线为:(1)从样品中提取微生物总DNA; (2) PCR扩増特定基因序列;(3)对特定基因序列扩增产物进行分析。根据PCR扩增片段的不同及扩增产物分离、分析方法的差异可分为以下几种技术|60'61|o

3.3.1 DNA长度多态性分析图谱

常用的DNA长度多态性图谱技术有RFLPT-RFLPRAPDDNA长度多态性分析的依据是生物的DNA片段的长度多态性【5%最初用于快速检定特定种群及进行菌株鉴定SI,后来用于研究微生物群落结构和多样性。

3.3.1.1限制性片段多态性分析(RFLP)

限制性片段多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)是最早在微生物分类中应用的指纹分析技术,现广泛用于研究土壤、水体和海洋沉积物等区系微生物群落的结构和多样性。其理论基础是:限制内切核酸酶识别双链DNA中的特定序列,并在特定位点将DNA切开,不同种真菌的同一基因碱基组成和序列不同使限制性内切酶识别的序列发生变化,结果是酶切后产生大小不同的DNA片段,这样用某一限制性内切酶处理不同真菌的DNA,经过凝胶电泳就形成不同的DNA条带〔63】。现在一般采用rRNA基因和ITS区域等具有一或两个限制性酶切位点的DNA信号分子进行PCR扩增,将扩增产物酶切后用聚丙烯酰胺凝胶对其进行分离并分析其片段多态性。据研究报道l64|,18S rDNAITS的限制性片段分析是真菌群落分析和种类鉴定的快速有效方法。RFLP方法要求己知微生物特定分类水平的DNA序列文库,以便设计和合成特异的引


物,限制性酶的选择是其关键之处"%

3.3.1.2末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)

末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP),发展了RFLP技术,不同的是在对ITS序列进行PCR扩增时采用5,末端具荧光标记的引物。并用自动测序仪分离酶切后的DNA片段,测序仪可以检测到在PCR程中采用荧光标记引物扩增的末端具荧光标记的扩增子。RFLP图谱复杂度高,而TRFLP方法只检测末端限制片段,得到的图谱简单一些。与传统的培养和显微观察方法相比,T-RFLP技术能更快速全面地在时间和空间上分析真菌群落的动态。已经被成功用于盐碱地中子囊菌群落的研究【匈。Lord等【的采用T-RFLP技术分析沙地样品中的真,发现对ITS区域进行T-RFLP分析所得到的真菌多样性比对18S片段分析结果更为丰,而且可以将群落中的真菌鉴定到种或菌株水平。T-RFLP技术可以被用于复杂微生物群落中的真菌分析料1

3.3.L3随机扩增片段多态性(RAPD)

随机扩增片段多态性(randomly-amplified polymorphic DNA, RAPD)是更为简单的研究某一环境样品真菌多样性的方法。利用随意设计的短的非特异引物(通常10bp)在不严格的PCR条件下(低退火温度)对基因组DNA随机扩增,其扩增产物电泳而产生了长度多态性指纹图谱|6刀。RAPD方法克服了RFLP方法的局限性,不需了解DNA序列,而且对少量完整性较差的DNA,也能得到分辨率较好的指纹图谱。另外,RAPD技术能够扩增整个基因组DNA,所以它能比RFLP分析更好地代表真菌的基因组特性。Wawer 等㈣利用RAPD技术对Coprinus psychromobidus23个菌株进行了分类和鉴定。姚健等用RAPD方法分析了农用化学品污染对土壤微生物群落DNA序列多样性的影响,得出群落DNA序列多样性指数、丰富度和均匀度,并比较不同群落基因相似程度"9】。但该方法的最大不足是需进行大量的引物筛选,且实验过程中影响因素多(如镁离子浓度及 PCR的退火温度),结果的可比性不强153】。

总之,DNA长度多态性分析图谱能够监测微生物群落结构的动态变化或者比较两个环境微生物样品种群结构的差异。它的局限性在于:a)不能提供关于种群组成的信息;b)重现性差;c)由于长度相同的DNA片段其序列可能不-样,,寸能会高估样品间 的相似性阿7%

3.3.2变性梯度凝胶电泳DGGE)和温度梯度凝胶电泳TGGE)

变性梯度凝胶电泳denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和温度梯度凝胶电泳temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)最初用于检测人类基因的突变,自被Muyer(1993)引入环境微生物学领域以来,现已广泛用于分析微生物的区系结构组成及动态变化卩折173】。DGGEATGGE的基本原理是:同样大小的DNA序列所含碱基不同,其Tm也有差异,甚至一个碱基对的不同,都会导致很大差异。在由DNA变性剂(甲酰胺)或温度形成的线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中,当DNA片段到达能引起其变性的甲酰胺浓度或温度时,双链会部分解开。发生了部分熔解的双链DNA分子的电泳速率下降,不同序列的分子将在胶的不同位置停止迁移El电泳完成后用核酸染色剂(硝酸银)对凝胶中的DNA染色。从理论上讲,DGGEGGE指纹图上的一个条带就代表一个微生物类群(分类水平可达种)。条带的数量表明样品中可能存在的真菌的种类数。分别将每条带切割下来并对其中的DNA进行测序,根据序列确定其种类。另外,凝胶中条带 的特征如密度可用于种群大小的分析。DGGE方法已被用于检测分析滨草根部的真菌感染和土壤样品中真菌群落的动态变化175761 o DGGEfTGGE的局限性在于由于电泳的限制大于400bp的片段就不能有效地分离,为了便于电泳的分析,提高分辨率,引物的5' 端有一个40bp左右的发夹结构,提高了引物合成的成本。另外,已有研究表明,不同序列的片断可能迁移到同一位置。所以,依据条带数得到的谱图的分辨结果不足以精确地揭示微生物群落的结构和多样性I、%

3.3.3单链构象多态性分析SSCP)

单链构象多态性技术Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP)是随着对人类基因组的研究而发展起来的用于检测碱基突变的技术,由日本的Orita等卩I创立。其原理是在不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空向构象,不同序列的单链DNA通过分子内碱基互补配对形成不同的空间结构,当这些分子在电场中泳动时,会受到凝胶不同的分子筛作用力,最终使这些长度近似而碱基序列不同的DNA分子分开I采用SSCP技术对环境中功能群落的监测最早是由Lee D-H等网报道的。Schwieger等㈣通过对根系微生物的分析表明SSCP可以很好的分析微生物群落的动态变化。Peters等网)用该法研究群落 的演替和菌种的多样性,指出SSCP方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰,适合对微生物群落结构和演替的分析。瞿波【糾对中国和欧美、尼泊尔的禾谷镰刀菌SSCP 多态性比较首次从分子水平上揭示了中国禾谷镰刀菌的遗传多样性和分布状况及其与尼泊尔、欧美菌系的差别。SSCP的局限性在于SSCP能够分离的序列过短(<300 bp), 在系统发育分析过程中不能提供太多的信息,且一条带中包含多个操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs)有一定的灵敏度限制,对不影响三维构象的部分序列的碱基替换无法检测到俸】。

以上几种方法是近几年来常用的微生物生态学研究的方法。总的来说,目前真菌多样性研究的每一种方法都有自身的优点和局限性,也都在发展和完善当中。传统培养分离技术积累了大量分类数据,为分子生物学技术提供了良好的材料,在功能特性的认识上有独特的优势。以DNA为基础的分子生物学技术直接分析环境中真菌种群结构及其与环境的关系,能够较准确地反映环境中真菌的物种多样性,并揭示了一些未知种类的真菌,其中DNA指纹图谱技术可同时分析多个样品,直观显示了种群构成和结构变化。在解决实际问题的过程中,应不仅限于一种方法,各种方法组合应用可减少由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差,提供了更加全面的群落组成方面的信息【4"3.83)

4本实验的研究目的和内容

利用一般的平板培养方法结合分子生态学方法,初步了解“大型黏菌复合体”的黏 菌和真菌种群构成,为以后的进一步探明“大型黏菌复合体”的成分、形成打下基础。 本论文主要研究内容:

(1) 利用玉米琼脂和燕麦琼脂的有饲培养技术从''大型黏菌复合体”中分离黏菌, 以实体解剖镜、光学显微镜和环境扫描电镜观察原质团和子实体的形态和结构,对分离 出来的黏菌做出分类鉴定。

2)运用传统的培养方法,结合克隆文库ITS序列分析和ITS区的T-RFLP分析对

“大型黏菌复合体”的真菌多样性进行初步调查。


第二章“大型黏菌复合体”黏菌的分离与鉴定

1材料与方法

1.1 “大型黏菌复合体”样品简介

本实验所研究“大型黏菌复合体”样品由本院标本室提供。该标本不规则形,直径lm,表面粗糙,附着有杂质,内部为乳白色,有韧性。

1.2样品的釆集

用无菌剪刀剪取样品后立即用无菌的烧杯从标本室密封带回,置于4C保存。

1.3培养基

(1) 玉米琼脂培养基(Com-Meal Agar medium, CMA) 11,34-441

玉米粉30g加入IL蒸馋水,煮沸1小时后纱布过滤,定容到1L,加入琼脂15g, pH自然。

(2) 燕麦琼脂培养基(Oat-Meal Agar medium, OMA) ""M

燕麦粉30g加入IL蒸馅水,煮沸1小时后纱布过滤,定容到1L,加入琼脂15g, pH自然。

(3) 水琼脂培养基(Water Agar medium, WA)心的

pH6pH5的水琼脂培养基:琼脂20g, 1L水,分别调pH值至65

pH自然的水琼脂培养基:琼脂20g, 1L水,pH自然。

(4) 细菌悬液(bacterial suspension) 11,34-441

将培养24小时的大肠杆菌斜面洗入10mL无菌水,制成乳浊状悬液。

(5) 燕麦粉(Ground Oat Flakes)

Edward F. Haskins (2005)的方法并改进,将燕麦片(非速溶)用干磨机磨成 细粉,以约1.5cm高度的量分装入有硅胶塞的试管,121。灭菌45min,备用。

1.4主要实验仪器

超净工作台

蚌埠净化设备厂

Zoom 2000实体解剖镜

Leica

光学显微镜

Nikkon

Quanta 400FEG热场发射环境扫描电镜

HITACHI

1.5黏菌的分离

(1) 实验时将样品在超净台用无菌生理盐水清洗干净,用75% (v:v)乙醇浸泡2min,然后用无菌水清洗2次,再用0. 1% (m:v)升汞浸泡1 min,最后用无菌水冲洗3 次,用无菌的解剖刀切去表面,将剩下的样品切成(1X1X1) cm的小块。检验表面消毒效果的方法为:吸取少量第三次漂洗消毒材料的无菌水,涂平板,经培养后若无微生物长出,证明表面消毒彻底。

(2) 将样品小块无菌操作放入玉米琼脂培养基,并滴入无菌水使培养基表面形成 '‘水层”,加入0.5mL大肠杆菌悬液,混匀,然后置于25C恒温箱避光培养,培养箱保

持湿度卜冋。7-8天后,观察到样品周围岀现小原质团,这时将无菌燕麦粉散布在原质团前缘最近处,并滴加无菌水。原质团继续生长,随后无菌操作切取原质团及其所在的培养基移入燕麦琼脂培养基,继续置于25C恒温箱避光培养,定期观察记录。

1.6原质团的纯化和子实体的诱导形成

待原质团迁移到燕麦琼脂培养基上并长满整个皿时,将原质团转移到直径150mm pH6水琼脂平板上迁移1天,再转移到pH5的水琼脂150mm平板上直至无霉菌和细菌生长。将原质团转移至150mm水琼脂平板上,饥饿和光照(9W)诱导形成子实体囹。

1.7黏菌的鉴定

收集成熟的子实体,用解剖镜、光学显微镜和环境扫描电镜对泡子、抱丝、囊被、囊轴、囊柄等进行观察拍照,参考相关文献确定种属地位"。

1.7.1子实体整体形态的观察

利用实体解剖镜在40倍下观察。

1.7.2子实体显微结构的观察

将子实体置于载玻片上,用眼科解剖刀将抱囊挑开,暴露岀抱子、泡丝、囊轴等。先滴加95%乙醇驱除气泡,在乙醇未完全挥发完时,加一滴2%的氢氧化钾溶液,然后吸去多余的氢氧化钾溶液,最后滴加8%的甘油作为载浮剂使泡子、泡丝分散利于观察, 盖上盖玻片,吸去多余的甘油,置Nikkon光学显微镜下观察冋。

选取数个自然干燥的完整子实体,用导电胶粘贴于环境扫描电镜的样品台上,将其中-个的弛囊挑开,暴露出弛子、泡總等〔旳。喷金后利用Quanta 400FEG热场发射环境扫描电镜在20kv下观察。

2结果与讨论

共进行了3批分离实验,从样品中分离出20株黏菌,经鉴定共有2个种,分属于绒泡菌目Physarales)钙皮菌科(Didymiacaae)的钙皮菌属(Didymium)和双皮菌属Diderma )。

2.1.1 疣泡钙皮菌Didymium verrucosporum A.L.Welden, Mycologia

46:98,1954 (附录图版1)

抱囊有柄,球圆或宽卵圆,下面脐凹,垂头,白色,径0.2-0.6mm,全高0.8-1.8mm (图版1-1,16,17)囊被膜质,无色,表面散布白色星芒状石灰质结晶(图版1-2,3) [4] 柄无钙,基部暗褐,向上渐细色渐浅,半透明橙褐色(图版1-4,20),基质层膜质,暗褐,不明显;泡丝黄褐色,分枝,少联结,有暗色结,末端色浅(图版1-5,6,19)囊轴球圆,白色,高约达囊腔的一半(图版1-18)抱子成堆时暗紫色,镜下堇紫色,有粗疣,疣常成丛,有时成脊线,径8-9mm (图版1-7,8,9,19)。原质团深褐色(图版1-10,11,12,13)。生境一般为枯叶。国外主要分布于美洲,日本,非洲,澳大利亚。国内分布于吉林省长白山区,台湾。疑为陕西新记录种15,86,8

2.1.2 扁垫双皮菌Diderma deplanatum Fries, Syst. Myc. 3:110,1829.附荣图版2)0

泡囊散生或成小群,垫状无柄,径l-1.5mm,或形成联囊体(图版2-1),弯曲成弧形或环形,中间略凹陷,白色或乳白色或浅紫色(图版2-14,15)囊被双层,外层光滑壳状,厚而脆,宙大小不等、紧密排列的球型钙质结晶颗粒构成(图版2-2,3) [85], 内层膜质有晕光,下部深橙色:囊轴缺或为宽圆凸起或为加厚的橙褐色囊基:抱丝暗紫色,简单或少分枝,常有刺或深褐色膨大结(图版2-4,5,6,17)抱子凹陷,成堆时暗褐色,光镜下黄褐色,具密疣,直径为(图版2-7,8,9,17)。原质团白色或橙黄色(图版2-10,ll,12,13)o生境一般为枯枝落叶和青苔上。国外主要分布于西欧,北美和日本。国内分布于东北,云南四絹87网。

本实验初步从“大型黏菌复合体”中分离出2种黏菌,疣抱钙皮菌Didymium verrucosporum)和扁垫双皮菌Diderma deplanatum)因为黏菌fS子在玉米培养基上易于萌发和需要充足的水分的特点,分离过程中将样品放入玉米琼脂平板并注入无菌水形“水层",同时加入大肠杆菌悬液。培养箱内也要保持湿润,恒温25°C避光培养。多数抱子24小时内会萌发形成黏变形体心七黏变形体吞噬供给的大肠杆菌,生长旺盛,7-10天内即可在样品周围的琼脂上观察到扇形具网脉的小原质团。这时原质团与霉菌及细菌混杂生长,利用原质团移动和迁移的特性,及时将小原质团连同琼脂无菌操作切下转入新鲜的燕麦琼脂平板,保持湿润,25°C恒温避光培养,小原质团继续生长成为成熟的大型原质团。将其中仍有杂菌伴生的原质团切下放入pH6水琼脂平板上迁移1天,再转移到pH5的水琼脂平板上直至无霉菌和细菌生长。其后饲喂纯培养以无菌燕麦片使原质团变得有活力,再转移至pH自然的水琼脂平板上。因为这2种黏菌的原质团分别为棕色和黄色,需要光照才能形成子实体囲。疣泡钙皮菌的原质团为显性原质团,深褐色,呈扇形,移动过程中扇形的弧面始终在前端,即原质团具有极性。伸展面的前缘较厚,边缘清晰,而伸展面的后部则为发达的网脉结构,在解剖镜40倍放大下可观察到原生质在菌脉中有节奏的往返流动。成熟的原质团经饥饿光照9W)2-4天,即可在琼脂表面或平皿侧壁形成子实体,为散生的有柄泡囊(图版1-14,15)。扁垫双皮菌的分离过程与疣泡钙皮菌基本相同,只是白色的原质团会因培养条件的不同有时呈橙黄色,网脉结构更发达(图版2-12,13),且会迁移到较干燥的平皿盖甚至皿外形成子实体(图版


2-16)o子实体无柄垫状,有时散生,有时形成环状或弧形的联囊体(图版2-14)

虽然从“大型黏菌复合体”中分离岀疣泡钙皮菌Didymium verrucosporum)和扁垫双皮菌(应derg deplanatum)这两种黏菌,但目前世界上对于这2种黏菌代谢产物的研究属于空白。在分离纯化黏菌的过程中发现这2种黏菌表现为与细菌、霉菌混合生长的特性,此特性与“大型粘菌复合体”的形成的关系因为人们对黏菌的成分和代谢产物 了解并不多,有待于进一步研究。


第三章“大型黏菌复合体”真菌多样性的初步
调查

本实验从3个方面调查真菌的多样性,即传统的平板培养方法结合克隆文库序列分析和T-RFLP方法。其中平板培养是用于估计微生物多样性的传统方法,需从琼脂平上将菌落分离出来,并对分离岀来的菌株,通过rDNAITS(the internal transcribed spacer ITS1-5.8S-ITS2 ribosomal region)测序以及与NCB1数据库中的中收录的同源DNA 序列进行比较分析来进行鉴定。克隆文库序列分析是从“大型黏菌复合体”中直接提取 总DNA,通过真菌的通用引物扩增rDNAITS区,再克隆进TA载体,构建克隆文库以分离不同的序列,然后对分离的序列测序进行定性分析。对于测得的序列,通过与NCBI数据库中已有的数据对比鉴定。T-RFLP方法同克隆文库序列分析一样,直接提取DNA后,通过真菌的通用引物抗搏rDNAITS区,但不同的是引物5,末端具有荧光标记,然后以四碱基的核酸内切酶对PCR产物进行酶切,酶切产物用自动测序仪进行分析,测序仪只检测末端具有荧光标记的片段,这样就可以以片段大小将不同序列分离,最后得到的图谱反映真菌的多样性。

随着对真菌分类鉴定的发展,真菌研究者都在寻找一种分辨力强、重复性好、敏感度高、价格低廉的真菌鉴定手段。rDNAITS区被认为是比较理想的信号分子。核糖体核糖核酸(rRNA)基因及其相邻的间隔区合称为rDNA,广泛存在于真菌的基因组中,rDNA由高度保守区和可变区组成,是一个高度重复并有转录活性的的基因家族,有几百个甚至数千个拷贝,真菌种类不同,染色体上的拷贝数略有差别,串联排列于特定的核仁染色体质区段OXI]整个基因簇可分为转录区和非转录区,转录区由编码5.8S18S28S的结构基因(外显子)和3种基因间的2个转录间隔区(内含子)(Internal Transcribed Spacer, ITS) ITS1. ITS2组成,共同组成一个转录单位,分开转录区的DNA 片段为非转录区(non-transcribed spacers, NTS)18S上游的转录外间隔区(ETS)组成基因间隔区(internal gene spacers, 1GS)—般 ITS (the internal transcribed spacer 1TS1-5.8S-ITS2 ribosomal region)是指位于18S rRNA 基因3'端与28S rRNA 基因5'之间的序列,包括ITS15.8S rDNA ITS2rDNA 中,编码5.8 S18 S28 S RNA 的基因最为保守,是科间或更高级阶元间的系统发育的良好标id[92]o ITS1ITS2别位于18S-5.8S rDNA5.8S-28S rDNA之间,由于不加入成熟的核糖体,所以受到的选择压力较小,进化速率较快,是中度保守的区段,其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异较为明显,这种特点使ITS区段的非常适合作为从分子水平上鉴定物种的靶序列,而且由于18S28S rDNA的高度保守性,据此可方便地设计上下游引物,并且ITS区片段较短,约lOOObp左右,易于克隆和序列分析。ITS序列已广泛应用于真菌中属内种间的系统发育研究和属内种间和亚种之间的分类鉴定。祝明亮等【931998ITS1ITS4为引物,釆用核糖体DNA转录间隔区ITSRFLP分析,对314个种的捕食线虫真菌进行了系统发育研究,证明了ITS区在不同的属间长度无明显的差异,酶切图谱种间差异明显,种内基本一-致。目前有多个真菌分类学研究小组成功地利用了这 个片段将几个属的真菌鉴定到种的水平,如毛抱子菌属、念珠菌属、曲霉属A】。

本实验的三种方法都以真菌rDNA (核糖体DNA)ITS区作为信号分子分析样品中真菌的种类。所用的扩增ITS区的通用引物为EF3RCNLITS4[95] (White et al, 1990),其中上游引物EF3RCNL1641是真菌特异性的扩增18S基因的通用引物EF3[96] 的反向互补序歹"(reverse complement of EF3)O ITS4是真菌28S基因5,端的互补序列,作为下游引物。估计扩增得到大小平均为650bp的片段。

3RCNL

T

- 18S|[5^]|28S

ITS4

650bp

2引物位点(未按实际比例)

Figure 2 primer location (not to scale)

第一部分平板培养方法研究真菌多样性

1材料与方法

1.1样品的釆集

同第二章1.2o

1.2培养基

(1) 马丁氏培养基(Martin medium)(真菌分离纯化培养基)

葡萄糖10g;蛋白月东5g; KH2PO4 lg; MgSO4 -7H2O 0.5g; 1/3000 孟加拉红lOOmL; 琼脂15g;蒸馅水800mL; pH自然。112°C灭菌30min,培养基温度降至45°C左右时,加入0. 03%链霉素溶液lOOmL,使培养基中的链霉素含量达到30/zg/mLo

(2) 马铃薯培养基(PDA)

将马铃薯去皮称取200g,切成小块加入800mL水煮沸30min,然后用纱布过滤,再加入葡萄糖20g,琼脂15g,溶化后补足水至lOOOmL, pH自然。121°C灭菌30min

1.3主要实验仪器

超纯水仪

Millipore 公司

Eppendoff高速台式离心机

Beckman 公司

3B型紫外分光光度计

Beckman 公司

电泳仪

BIO-RAD 公司

Eppendoff PCR反应扩增仪

Beckman 公司

1.4真菌的分离和纯化

(1) 实验时称取不同部位的样品200g,将样品在超净台用无菌生理盐水清洗干净, 用75% (v:v)乙醇浸泡2min,然后用无菌生理盐水清洗2次,再用0. 1% (m:v)升汞浸Imin,最后用无菌生理盐水冲洗3次,用无菌的解剖刀切去表面,将剩下的样品放入无菌的组织捣碎机,加入200mL无菌生理盐水磨碎,得到样品悬液。检验表面消毒效果的方法为,吸取少量第三次漂洗消毒材料的无菌水,涂平板,经培养后若无微生物长出,证明表面消毒彻底。

(2) 采用平板稀释涂布法分离真菌,取ImL样品悬液于无菌水中制成101-105浓度梯度的稀释液,分别取0.2mL涂布于马丁平板上,5个重复,30C培养3-7天。初步根据形态特征分离纯化并且统计每种菌的发生频率,排除重复,编号,转入斜向保藏。

1.5真菌的鉴定

利用对rDNAITS区测序的方法鉴定真菌。

1.5.1真菌基因组DNA的提取

用真菌基因组DNA 试剂盒(Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit, Bioflux) 提取各菌株基因组DNAo

(1) 将菌种在PDA斜面转接2次活化后,斜面挖块法接入PDA液体培养基,30°C, 200r/min振荡培养3天。取培养物以9000Xg离心lmin,弃去上清液。

(2) 分别用无菌的1.5mL离心管称取少于50mg的真菌组织(先称空白管,再加入称 取物),将离心管插在泡沫板中,戴上棉手套徐徐倾斜,缓缓加入液氮,用无菌镶子将 菌体组织捣碎成细粉,捣碎期间不断注入液氮使样品不融化。

(3) 40QuLLE Buffer,并混合均匀。于65C中温浴30min,过程中漩涡振荡离心管,混合均匀。

(4) 加入130«L DA Buffer,混合均匀后于冰浴中放置5分钟。于14000Xg离心3 分钟。将上清液转移到一个新的1.5mL离心管。加75QuLE Binding Buffer,并混合均匀。

(5) 将混合液转移至Spin columno6000Xg离心lmin,并弃去接液管中液体。

(6) spin column 中加入500/zL G Binding Buffero 10000Xg 离心30s> 并弃去接液管中液体。Spin column中加入60QuLwash buffero10000Xg离心30s, 并弃去接液管中液体。

(7) 童复上-步。

(8) 再次将spin column F 10000Xg离心Imin.并将spin column转移至一个新的1.5mL 离心管。向spin column 中加入lOQuLElution Buffer,并于室温温浴Imin12000 Xg 离心Imin,并奔去spin column., DNA 即在1.5mL 离心管中的Elution buffer 中。

(9) 别取以L用紫外分光光度计测定DNA含量。剩下的用无菌去离子水稀释为10ng/^L ,分装并于-20C保存备用。

1.5.2 rDNAITS区的扩增

通用引物EF3RCNLITS4被用于rDNAITS区段的PCR扩增,由北京奥科合成,序列分别为:

EF3RCNL: 5,-CAAACTTGGTCATTTAGAGGA-3,

ITS4:5' -TCCTCCGC7rTATTGATATGC-3'

以真菌总DNA为模板,用2XPfu PCR Mastermix (TIANGEN)扩增真菌的ITS区,长度大约为650bpPCR反应体系(50//L)如下:

ddH2O 19/zL

primer EF3RCNL 2^L(10/zM)

primer 1TS4 2//L(lQuM)

2XPfu PCR Mastermix 25//L

template 2“L (10ng/uL)

PCR 扩增反应条件:94°(?变性2 0194°C 1 min , 53°C Imin, 72°C 2 min, 35 循环:最后72°C延伸10 mine1.2%1XTAE琼脂糖凝胶以lkb laddermarkerPCR产物进行电泳(60V, 60min)检测。

1.5.3 PCR产物的纯化和测序

PCR产物的纯化使用DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN)o

(1) lOQuLPCR产物加入到1.5mL离心管中,再加入5倍体积即50Q«L结合液PB,充分混匀。

2)将所有溶液放入吸附柱中,室温放置2min, 13,000rpm离心60s,弃去收集管中的液体。

3)向吸附柱内加入70QuL漂洗液PW, 13,000rpm离心60s,弃去收集管中液体。

4)再向吸附柱内加入500//L漂洗液PW, 13,000rpm离心60s,弃去收集管中液体。

5)将吸附柱放回收集管,13,000rpm离心2min,除去漂洗液。后将吸附柱.置于 50C温箱lOmin,使漂洗液中的乙醇完全挥发。

6)将吸附柱放入另一个新的离心管中,向吸附膜中间悬空滴加20^L70°C水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置。13,OOOrpm离心Imin收集DNA溶液。

7)将离心得到的溶液重新加入吸附柱中,再次13,000rpm离心2min收集DNA 溶液。

提供纯化的PCR产物直接测序。测序由北京奥科完成。

1.5.4菌株分类鉴定的分析与判断

将各菌株rDNA ITS区序列与NCBI数据库中收录的序列All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences , but no EST, STS,GSS, environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)进行BLAST (局部相似性基本査询工具)分析,搜索到同源DNA序列并进行比较分析。根据BLAST的结果,判断菌株的种或与其近缘的种。在数据库选岀与各菌株序列相似性较高的真菌,使用ClustalX (Version 1.83)软件进行多序列比对alignment),MEGA3.1构建系统发育树。

2.结果与分析

2.1 rDNA ITS区扩增、测序结果与分子鉴定分析

2.1.1 PCR扩增结果

从各菌株提取到的基因组DNA经紫外分光光度法检测,OD260/OD2801.7,取的DNA 溶液浓度如下:Fl 328nL F2 167 ng/L F3 250 ng/^L F4 527 ng^zL F5 79 ng///L F6 208ng/L

以各菌株的基因组DNA为模板,对rDNAITS区进行PCR扩増,经电泳检测,各菌株均得到了大小为600-650bp左右的H的片段,无其他非特异性条带。图2各歯株PCR扩增产物的电泳检测结果。

西北图六.png

Figure3 ITS region PCR products of each strain

M: 1 kb ladder 1,2: Fl 3,4: F2 5,6: F3 7,8: F4 9,10: F5 11,12: F6.

2.1.2测序及分子鉴定结果

(1)菌株Fl

测得的菌株FlrDNA ITS区序列见附录2。共595bp, BLAST结果表明与Accession number AF368810.1 Acremonium implicatum ITS 区序列最为相似(identities 99%, Score 1044 bits, expect value 0),具体比对结果(alignment)见附录2

可初步判断菌株Fl属于枝顶泡霉属(Acremonium),可能为交织顶泡霉Acremonium implicatum»枝顶泡霉属Acremonium)属于半知菌亚门丛梗抱目(Moniliales)丛梗泡(Moniliaceae )丛梗拖科单饱亚科(人merosporoideae of Moniliaceae )葡萄弛族 Botrytidea" 此属分生弛子梗从菌丝生出或在子座上形成,较长,不分枝,单枝或顶端分枝,不膨大也不轮生,分生泡子梗无小齿,疏松,蛛网状;分生泡子球形、卵圆形,光滑,顶生或侧生,常单生印


(2) 菌株F2

测得的菌株F2rDNA ITS区序列见附录2。共620bp, BLAST结果表明与Accession number AF455502.1 Trichodertna inhamatum isolate wb265 ITS 区序列最为相似(identities 98%, Score 1088 bits, expect value 0)» 具体比对结果(alignment)见附录2

初步判断F2属于木霉属(Trichoderma),可能为Trichoderma inhamatum。木霉属属于半知菌亚门丝砲纲丛梗泡目(Moniliales)丛梗弛科(Moniliaceae)丛梗泡科单泡亚(Amerosporoideae of Moniliaceae)头抱霉族(Cephalosporieae)菌丛密集如毡,分生弛子梗从菌丝的侧枝生出,直立,分枝,小枝常对生,顶端不膨大,上生分生砲子团;分生砲子球形,浅色或无色【97】。

(3) 菌株F3

测得的菌株F3rDNA ITS区序列见附录2。共578bp, BLAST结果表明与Accession number AJ279994.1 Aspergillus japonicus ITS 区序列最为相似(identities 99%, Score 1014 bits, expect value 0)» 具体比对结果(alignment)见附录2

初步判断F3属于曲霉属(Aspergillus),可能为日本曲霉(Aspergillus japonicus)霉属属于半知菌亚门丝抱纲的丛梗抱目(Moniliales)丛梗泡科(Moniliaceae)丛梗拖科单弛亚科(.Amerosporoideae of Moniliaceae')曲霉族(.Aspergilleae)有性世代属于子囊菌曲霉科(Eurotiaceae)的散子囊菌属(Eurotium)密丝明砲曲霉属(Sartorya)和泡波曲霉属(皮mericella)"。

(4) 菌株F4

测得的菌株HrDNA ITS区序列见附录2。共588bp, BLAST结果表明与Accession number AY373902.1 Penicillium chrysogenum strain FRR 807 ITS 区序列最为相似(identities 99%, Score 784 bits, expect value 0),具体比对结果(alignment)见附录2

初步判断F4属于青霉属(.Penicillium'),可能为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)o 青霉属属于半知菌亚门丝弛纲丛梗抱目(.Moniliales')丛梗科(Moniliaceae)丛梗泡科单地亚科CAmerosporoideae of Moniliaceae)曲霉族(Aspergilleae)°产黄青霉归入不对称青霉组、绒状青霉亚组、产黄青霉系,是典型的青霉素生产菌。分生抱子梗表面光滑,150350 nm,3-3.5 um,2~3个分枝,帚状枝不对称,有长短不等的副枝,其上长出梗基和小梗。小梗4~6个轮生,其上产分生砲子链。分生抱子椭圆形(2

4)umX(2.83.5)m,表面光滑印】。

(5) 菌株F5

测得的菌株筋的rDNA ITS IX序列见附录2。共571bp,BLAST结果表明与Accession number DQ535186.1 Nectria haematococca mpVI strain HKU-543 ITS 区序列最为相似(identities 98%, Score 994 bits, expect value 0),具体比对结果(alignment)见附2

初步判断F5属于丛赤壳属(Nectria),可能为血红丛赤壳菌(Nectria haematococca)。 丛赤壳属属于子囊菌亚门肉座菌目(Hypocreales)肉座菌科(Hypocreaceae')o血红丛赤壳菌子囊壳散生或生于不发达的子座上,颜色鲜明;子囊含8个拖子;无性世代常发生, 无性态为茄病镰抱甘薯专化型(Fusarium solani),半知菌类镰泡属

(6) 菌株F6

测得的菌株FrDNA ITS区序列见附录2。共550bp, BLAST结果表明与Accession number AY533376.1 Gibberella moniliformis ITS 区序列最为相似(identities 99%, Score 992 bits, expect value 0),具体比对结果(alignment)见附录2

初步判断F6属于赤霉属(Gibberella可能为藤仓赤霉(Gibberella moniliform is)。 赤霉属属于子囊菌亚门肉座菌目(Hypocreales)肉座菌科(Hypocreaceae)子囊抱子无色,梭形,有隔膜2-39刀。无性世代大都属于镰抱属。藤仓赤霉其无性阶段称串珠镰如霉(Fusarium moniliforme).气生菌丝呈白色、浅粉红色或淡紫色。野生菌株一般产泡子较多。分生抱子有大小两型:大者为镰刀形、纺锤形、棍棒形、线形等,壁薄而透明,一般分36隔;小者为椭圆形、纺锤形、卵形、梨形或腊肠形,透明,无隔或有12 隔,(37)mX(24.8)nm排成串或假头状。在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的气生菌丝呈絮状蔓延。有时在菌落中央产粉红色或粉红色至肉桂色的黏泡团,其中含大量小型和大型分生砲子。菌落背面为淡黄、淡赭或淡紫红等色。有性阶段形成深蓝色的球形或卵形子囊壳、外部有疣状突起或粗糙。子囊呈圆筒形或香肠形,顶平坦,内含48个椭圆形子囊抱子。

2.1.3平板培养获得菌株的系统发育树

在数据库选出与各菌株序列相似性较高的真菌,使用ClustalX (Version 1.83)软件进行多序列比对(alignment),MEGA3.1构建系统发育树。

4^533376 Gbberella /VM55450 Gbberella AV729054 Fusariun F6

□0907616 Gbberella

西北图七.png西北图八.png

从以上来看,绝大多数真菌是半知菌亚门丝泡纲和子囊亚门的真菌,其中枝顶泡霉 属、木霉属和青霉属占优势。由于真菌除以菌丝状态存在外,还可能以各种抱子和菌核 等形式存在,而平板稀释涂布法是一种抱子真菌的分离方法,平板培养中大多数菌落来 源于真菌抱子,其对快生长、多产抱子的真菌种类分离是有利的t98'"]o而且培养基的成份影响微生物的生长状况,故培养基的选择可强烈影响所得菌落的多样性m只有一小部分微生物群落可用这种方法得到。根据Amann”"的评估,大约80%~99%的微生物种不可培养或未能得到培养,说明大部分微生物不能用传统的平板培养技术来描述。应用这种方法分离到的真菌几乎全部为総砲纲的半知菌,所以这种分离真菌的方法并不能真实地反映真菌的生存状态与种群分布,结果有误导性。本实验分离真菌选用马丁氏培养基,梁晨等'网指出在沙氏培养基和子囊琼脂培养基上生长的真菌单一,以青 霉菌、曲霉菌、木霉菌为主,且对菌丝的抑制作用较弱,不利于纯化,土壊浸汁培养基 利于腐生性较强的真菌生长,而真菌分离时孟加拉红培养基的分离效果最好,获得的真 菌种类较多,对细菌有较好的抑制作用,同时抑制真菌菌丝的生长,便于真菌纯化和菌 落计数。

第二部分克隆文库序列分析法调查真菌多样性

1材料与方法

1.1主要实验仪器

同本章第一部分1.3

1.2实验药品

Biospin Fungus Genomic DNA Extraction KitBioflux

2 X Pfu PCR MastermixTIANGEN

DNA extraction kitMBI

pGM-T克隆试剂盒TIANGEN

重组菌落PCR鉴定试剂盒TIANGEN

1.3样品的采集

用无菌剪刀剪取样品后立即用无菌的烧杯从标本室密封带回,置于4C保存。

O

1.4样品真菌基因组DNA的提取

(1) 实验时称取不同部位的样品200g,将样品在超净台用无菌生理盐水清洗干净, 用75% (v:v)乙醇浸泡2min,然后用无菌生理盐水清洗2次,再用0. 1% (m:v) 升汞浸泡Imin,最后用无菌生理盐水冲洗2次,用无菌的解剖刀切去表面。检验表面消毒效果的方法为,吸取少量第三次漂洗消毒材料的无菌水,涂平板,经培养后若无微生物长出,证明表面消毒彻底。

(2) 将剩下的样品放入无菌的组织捣碎机,加入200mLTE缓冲液(Tris • Cl 10mM, EDTAlmM, pH 8.0)磨碎。将捣碎液用灭菌纱布过滤除去碎块,得到样品悬液。

(3) 注射器用滤器中放入0.22/zm微孔滤膜灭菌,无菌注射器吸取处理后的溶液,和

注射过滤器连接,推射过滤溶液200mLo

(4) 倾斜放置灭过菌的始养皿,加入ImETE缓冲液(TrisCl 10mM, EDTAlmM, pH 8.0)o把过滤后的膜放入缓冲液中,用无菌吸管吸取缓冲液反复吹打滤膜,将膜上的黏着物洗卜。将得到的缓冲液以10000Xg离心Imin,弃去上清液。

(5) 称取略少于50mg的沉淀物(先称空白管,再加入沉淀物)分别放入几个1.5mL 离心管中,将离心管插在泡沫板中,戴上棉手套徐徐倾斜,缓缓加入液氮,用无菌镣子将沉淀物捣碎成细粉,捣碎期间不断注入液氮使样品不融化。

(6) 400.LLE Buffer,并混合均匀。于65C中温浴30min,过程中漩涡振荡离心

管,混合均匀。

(7) 加入130//LDABuffer,混合均匀后于冰浴中放置5分钟。于14000Xg离心3钟。将上清液转移到一个新的1.5mL离心管。加750//LE Binding Buffer,并混合均匀。

(8) 将混合液转移至Spin column06000Xg离心Imin,并弃去接液管中液体。

spin column 中加入500/zL G Binding Buffer» lOOOOXg 离心30s,并弃去接液管中液体。Spin column中加入600/zLwash bufferlOOOOXg离心30s» 并弃去接液管中液体。

(9) 重复上一步。

(10) 再次将spin columnlOOOOXg离心Imin,并将spin column移至一个新的1.5mL 离心管。向spin column 中加入100//LElution Buffer,并于室温温浴Imin12000Xg离心Imin,并弃去spin columnoDNA即在1.5mL离心管中的Elution buffer 中。

(11) 分别取5//L用紫外分光光度计测定DNA含量。剩下的用无菌去离子水稀释为lOng/^L ,分装并于-20C保存备用。

1.5样品真菌ITS区的扩増

PCR扩增反应所用引物、体系及反应条件同本章I平板培养方法研究真菌多样性中1.4.2 rDNA ITS区的扩增。

1.6 PCR产物的切胶回收纯化

使用DNA extraction kit (MBI)PCR产物的切胶回收纯化。

1)用手术刀切下含DNA条带的胶,尽量切去多余的胶。为了减少对DNA的伤害,尽量减少在紫外卜暴露的时间。放入一个离心管中,通过lg约等于ImL确定胶的体积。胶被切为2mm小块有助于溶解。

2)3倍体积的Binding solution., 55°C温浴5-10min溶解胶。温浴中每2-3min涡振荡离心管。若胶温浴后未溶解,再温浴l-2min直到溶解。

3)加入再次悬浮的silica powder suspension □l.g 加入2/zL silica powder suspension, 55°C温浴5分钟。温浴中每l-2min漩涡振荡离心管保持silica powder 悬浮。

4)以最大速度(大于13000rpm,10000G)离心5秒,形成pellet,将上清移至新管保留。再离心2-3秒用移液器吸去残留的binding solution□

5)加入50QuL冰冷的Washing buffer,漩涡振荡,使pellet完全再悬浮,最大速度离心5秒。弃去上清。重复3次。最后的上清弃去后,再次最大速度(大于13000rpm,10000G)离心5秒,用移液器吸去残留液体。风干pellet 10-15min可能去除乙醇以免抑制后续步骤的酶的活性。。

6)12.5gDNA加入5/UL 大于2.5的,每lg加入2//L)的灭菌去离子水漩涡振荡再悬浮pellet, 55C温浴5min最大速度离心30秒,将含DNA的上清移入一个新管中。再用2份灭菌去离子水重复2次洗提。为了除去少量的silica powder,以最大速度再次离心所得上清液30s,转移上清至新管。取5-L用紫外分光光度计测DNA含量。洗提的DNA用于后续克隆。

1.7转化

转化使用pGM-T克隆试剂盒TIANGEN),PCR产物与T-载体连接,转化入TOP10 感受态细胞。

1.7.1 PCR产物的连接

1.7.1.1 PCR 产物3'端加A

因为PCR反应使用pfu酶,产物为平末端,需要先在产物3,端加A

反应体系如下•:

DNA片段

15/zL

A反应液

4//L

A-tailing Enzyme

1“L

反应条件:72°C

30min

1.7.1.2 连接

根据紫外分光光度计检测插入片段浓度,利用公式(50ngXsize of insert/size of vector) Xinsert/vector=insert(ng),计算需加入的片段的量为86.2355ng样品代号为S0.5ml离心管中加入以下成分(10//L反应体系):

反应体系

样品S

对照体系Ins

目的片段

3/zL

对照插入片段1L

载体(50ng/^L)

1//L

1L

10XT4 DNA ligation buffer

1//L

1/zL

T4 ligase (3U//L)

1«L

1“L

无菌去离子水

4“L

6“L

将离心管内液体混匀,16C连接过夜,

,反应结束后离心管置于冰上。

1.7.1.3转化平板的制备

LB/Amp/X-Gal/IPTG 平板:称取Tryptone 10g, Yeast Extract 5g, NaCHOg,加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。滴加5N NaOH (0.2mL),调节pH值至7.0,加入去离子水定容至1L,加入15g Agaro灭菌后,冷却至60°C,加入ImLAmpicillin (100mg/mL)ImLIPTG (24mg/mL)2mL X-Gal (20mg/mL)后混合均匀,铺制平板,4°C避光保存。


1.7.2连接产物的转化

(1) 将感受态细胞从-70°C冰箱取岀放于冰上解冻。刚融化时分别取样品De,样品Dm

和连接对照Ins的连接产物5L加到IOQuLTOPIO感受态细胞中。同时加1“L pUC19 (O.lng/^L)100//LTOP10感受态细胞作为转化对照。吹吸混匀,冰浴30min

(2) 将离心管置于42C水浴90秒,取出后立即置于冰浴2-3min,其间不要摇动离心

管。

(3) 向离心管加入500/ZL37C预热的不含AmpicillinLB培养基,150rpm, 37。振荡培养lh使质粒上的抗性基因表达,菌体复苏。

(4) 将离心管中菌液混匀,吸取lOQuL涂布于1个平板中。加到LB/Amp/X-Gal/IPTG

平板,用灭菌的刮铲轻轻的将细胞均匀涂开。待表面干燥后,倒置平板,37°C16个小时。

1.8克隆ITSDNA的序列分析

1.8.1 ITSDNA的测序

将长出的白色菌落挑入标记好的平板内,用重组菌落PCR鉴定试剂盒重组鉴定,用灭菌牙签挑取很少一部分单菌落加到以下反应体系,并使菌体分散混匀。

T7 Primer (10“M)1“L

SP6 Primer(lO^M)1“L

2 X Pfu PCR Mastermix10//L

ddH2OL

PCR 扩增条件:94°C变性3 min 94°C 30s , 55°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环;最72°C延伸5 min反应结束后取5//L1.2%的琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳检测,有目的条带的菌落即为阳性克隆。

将阳性克隆挑入2mLAmpicillinLB培养基,培养12-16个小后进行测序,测序编号为clc2c3> c4c5c6c7c8c9clOellcl2cl3cl4> cl5cl6,

测序」作由北京奥科完成

1.8.2 ITS区序列相似性分析及系统发育树的构建

将获得的真菌rDNA ITS区序列与NCBI数据库中收录的序列进行BLAST.搜索到同源DNA序列并进行比较分析。根据BLAST的结果,判断菌株的种或与其近缘的种。在数据库调出与各序列相似性较高的真菌ITS序列,使用ClustalX (Version 1.83)软件进行多序列比对(alignment),MEGA3.1构建系统发育树。

2结果与分析

2.1 “大型點菌复合体”真菌ITSPCR扩増结果

“大型黏菌复合体”提取到的DNA经紫外分光光度法检测,OD260/OD280>1.7,提取的DNA溶液浓度91ng//zLo以总DNA为模板,对rDNAITS区进行PCR 扩增,经电泳检测,得到了大小为600-700bp左右的目的片段,无其他非特异性条带。4PCR扩增产物的电泳检测结果。

ITS region PCR products of total DNA extracted from the sample, 5 replicates. 600-700bp

西北图十.png

5 “大型黏菌复合体”直接提取DNAITS区扩増结果

Figure 5 ITS region PCR products of total DNA extracted from the sample


随机挑选16个阳性克隆,对T-载体上克隆的真菌ITS区进行测序。测得的序列用DNAStar去除两端的载体序列后,与NCBI数据库中收录的真菌ITS序列进行BLAST 分析,得到了与之相似性最高的真菌(表5)

西北图十一.png

其中曲霉属、青霉属、枝顶泡霉属也在平板培养中分离到,而枝抱属(Cladosporium\ 葡萄状穗霉属(Stachybotrys)石座菌属(Pemwiyces)和帚枝霉属(Sarocladium)在平板分离中未得到。克隆文库法显示枝顶泡霉属可能占优势,也是平板培养得到的优势属之一。事实上以克隆的拷贝数代表样品中该种群所占的比例,所获得的信息是离散的,必然产生随机误差,降低误差的方法是进行大量的克隆和分析工作,而因为经费和时间的原因本实验选取的克隆数较少,所以只能初步判断枝顶砲霉属是可能的优势类群之一。

2.3克隆文库的系统发育树

在数据库选出与各菌株序列相似性较高'的真菌的ITS序列,使用ClustalX (Version

1.83)软件进行多序列比对(alignment),MEGA3.1构建系统发育树。

图十二.png

第三部分T-RFLP方法调查“大型黏菌复合体"真菌多样性

T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism)在技术上与KFLP 相似。先提取待分析样品的总DNA,釆用一对引物扩增样品中目的DNA片段(一般为rDNA), 其中一个引物的5,端用荧光物质标记,常用的荧光物质有HEXTET6-FAM等,这样所得的PCR产物就带有这种荧光标记,后进行酶切(通常是四碱基的酶),酶切产物用 自动测序仪进行检测(选用genescan功能),即进行利用有激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, L1F)检测器的毛细管电泳。只有末端带荧光标记的片段能被检测到,而其它没有带荧光标记的片段则检测不到。对于不同种类的微生物,酶切位点距离荧光标记5 '端的长度不同,所以每一种长度的末端限制性片段(Terminal Restriction Fragment,TRF)至少代表1种微生物或分类操作单元(OTU)末端限制性片段技术不但可以进行微生物种类的定性分析,还可以进行定量分析。在基因扫描图谱上,每个峰的面积 占总面积的百分数就代表了这个末端限制性片段的相对数量,即对应的限制性片段峰面 积大,就说明末端限制性片段的相对数量大,但是并不能说明这种末端限制性片段所对 应的微生物的数量也一定大,这是因为微生物基因组上的核糖体基因是以多拷贝的形式 存在,而且拷贝数不尽相同卩°%单纯的T-RFLP可以提供微生物的种类和相对数量的信息,但还无法确定是何种微生物,定性信息不足。结合克隆文库分析或者核酸杂交分析,就能确定微生物的种类,或者将已知的纯培养物进行T-RFLP,通过纯培养菌株的T-RFLP 图谱与样品的图谱进行比较,从而对样品中相应的微生物进行定性和定量。但是,上述这些方法都未能充分利用T-RFLP图谱中的信息,仅对部分片段进行考察.the University of Wisconsin-Madison 建立了基于Web (http://trflp.limnology.wisc.edu/) T-RFLP 数据分析方法(Web-based Phylogenetic Assignment Tool, PAT)使用者在该网站选择包含所要研究的TRFs的数据库,上传从自动测序仪获得的数据,选定所使用的限制性内切酶,通过检索可以获得每个峰可能代表的微生物I04】。T-RFLP的优点在于,在DNA自动测序仪上有高分辨率的分离,核酸测序技术要比DGGE或者SSCP所依赖的电泳系统获得的结果更为可靠;分析快速,并可输出数字化的结果。T-RFLP结合了PCR技术、限制性核酸内切酶技术、毛细管电泳技术、荧光标定技术和DNA自动测序技术,是在DNA 水平上通过对特定DNA片段多态性的测定来分析微生物的多样性53,631

1994Avaniss-Aghajani等皿厝次使用该力法鉴定复杂混合物中的不同细菌。目前T-RFLP E要用在细菌群落的研究上,如Clement等调查了3种环境中的细菌群落,用T-RFLP ”以清楚地区分这3种细菌群落卩°6

至于在真菌多样性的研究中,是1998Marsh等卩°刀首次将T-RFLP技术应用到真核生物群落结构的调查。他用真核生物18SrDNA保守区特异的引物扩增岀真核生物的SSUrDNA,同时进行了T-RFLPDGGE和克隆文库序列分析。T-RFLP分析获得15TRFs,DGGE所能检测出的核糖型(ribotype)2倍,并结合克隆文库序列分析,鉴定了样品中的优势种。2002Buchan等卩咧利用T-RFLP调查了美国东南部盐沼地的真菌群落。因为目前关于T-RFLP分析的公共数据库和工具,如MiCA( Microbial Community Analysis, http://mica.ibest.uidaho.edu/), PAT 等,主要是基于细菌的16SrDNA 信息,真菌并没有公开相关数据库,所以一般是研究机构将得到的己知真菌的T-RFLP模式

(T-RFLP patterns)自建一个数据库(reference database)利用TRAMP 程序(Dickie et. al, 2002)与未知真菌的T-RFLP模式比较,从而鉴定环境样品中真菌印刃。因为这些数据库并不公开,所以本实验通过纯培养已知菌株的T-RFLP图谱与样品的图谱进行比较,从而对样品中相应的真菌进行分析。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

西北图十三.png

1.2样品的采集和处理

同本章第二部分1.3

1.3样品总DNA和菌株基因组DNA的提取

同本章第一部分1.4.1和第二部分1.4

1.4样品和菌株ITS区的扩增

分别以样品(代号为S)DNA和平板分离的6株真菌F1-F6)的基因蛆DNA模板,共7个模板分别扩增ITS区。PCR反应条件及体系同本章第二部分1.5,但使用上游引物EF3RCNL5,端标记FAM的荧光引物(引物分装、保存时需避光),由上海超世合成,序列分别为:

EF3RCNL: FAM-5' -CAAACTTGGTCAITTAG AGG A-3'

ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATArGC-S5

1.5 PCR产物的切胶回收纯化

同本章第二部分1.6

1.6 PCR产物酶切消化

将纯化好PCR产物,用限制性内切酶Hpall进行酶切。操作如下:

20HL反应体系:

西北图十五.png

使反应物充分混合,37°C酶切3h,终止反应时65°C水浴20mino 4%琼脂糖凝胶酶切产物和未酶切的PCR产物同时上样5ML检测。剩余的酶切产物每管加入50虬无水乙醇, 2" 3M NaAc,振荡混匀,避光室温静置15分钟,12000g, 4°C离心30分钟,弃上清,加入70%乙醇洗涤,12000g, 4°C离心15分钟,弃上清,开盖静置等乙醇挥发干净。

1.7酶切产物genescan

10RL去离子甲酰胺重新悬浮消化的DNA ,加入0.5Rox500 size standard(Perkin-Elmer)作为内标,旋涡混合器上混匀。95°C变性5min, '7.即冰浴冷却。4 °C保存。在AB1 PRISM 310 Genetic Analyzer上进行毛细管电泳。电泳凝胶为Performance Optimized Polymer 4,毛细管为47cm电泳设置参数为:注样时间7sec., 加样电压15KV,电泳电压15KV,电泳电流12u A,电泳温度60°C,激光功率9.9嗣,

收集时间40min50~500bp的核昔酸以GeneScan Analysis Software分析处理得出HDNA信息,得到genescan图谱(以上操作由上海超世进行)

2结果和讨论

2.1样品和菌株ITS区的扩增结果

分别以样品总DNA和平板分离的6株真菌的基因组DNA为模板,共7个模板分别扩ITS区。经电泳检测,得到了大小为600-650bp左右的目的片段,无其他非特异性条带。图78PCR扩增产物的电泳检测结果。

西北图十六.png西北图十七.png

西北图十八.png西北图十九.png

90.70, 136.09, 150.00, 157.09, 160.00, 168.76, 209.24, 230.93, 267.75, 347.62356.14

367.58386.29416.63422.26。将各菌株的片段长度与样品S的各片段长度进行比对

发现,样品S 160.00bp 对应F1 162.00bp, 136.09bp 对应F2 138.46bp, 157.09bp 对应F4155.26bpo因长度差别小于2bp的片段就可被认为属于相似的菌株(Kaplan, 2003),所以可判断检出了枝顶饱霉属(/4cregAn's)木霉属(Trichoderma)和青霉(Pcilm)一般图谱中的末端片段数目,即峰的数目被看作样品中真菌类群数目的最小估计值,所以样品S的图谱至少有18个末端片段峰可以辨别,说明“大型黏菌 复合体”中的真菌至少包括18个不同的类群,其中157.09bp的峰面积较大,表明青霉属可能为优势类群之一,其他面积较大的峰150.00bp168.76bp267.75bp未能与平板分离的菌株对应,说明这些可能的优势类群也许难以用平板分离。因为青霉属也是平板分离中的优势类群之一,所以可以说青霉属是“大型黏菌复合体”的优势类群,当然优 势类群还包括T-RFLP分析中其他3个未得到鉴别的类群,相信随着真菌序列数据库的发展,未来会像细菌一样可以直接在公共数据库中直接分析得到鉴定。目前国内主要应T-RFLP技术调查细菌群落,尚未见到利用T-RFLP技术分析真菌群落的研究,

本实验通过T-RFLP分析获得18TRFs,是平板分离获得类群的3倍,克隆文库获得类群的2倍,并结合平板分离菌株的序列分析,鉴定了样品中可能的优势属。

本章小结及讨论

本章从3个方面即传统的平板培养方法、克隆文库序列分析和T-RFLP方法调査了“大型黏菌复合体”真菌的多样性。初步得知“大型黏菌复合体”的真菌构成为枝顶泡 霉属、青霉属、曲霉属、木霉属、丛赤壳属、赤霉属、枝抱属、葡萄状穗霉属、石座菌 属和帚枝霉属。其中枝顶地霉属、木霉属和青霉属占优势,且TRFs显示至少有18个类群的真菌。因为3种方法都有自身的局限性,所以可以预见单一的技术并不能完全准确的描述真菌种群构成,影响“大型黏菌复合体”真菌多样性调查的潜在的因素如下:

(1) 取样的影响

取样均匀度和样品量是真菌多样性调查的第一个可能影响。样品处理时虽然尽量选取不同部位混合处理,但“大型黏菌复合体”中微生物的高度多样性和分布异质性,可 能导致对真菌丰度总量评价片面。同时一般真菌DNA在环境样品中的含量较细菌少10 倍甚至几个数量级之多〔11%使得真菌多样性的调查数据没有细菌多。

(2) DNA的提取

DNA的提取是一个非常关键的步骤。因为准确的分析首先依赖于能否从“大型黏菌复合体”中毫无偏差地回收DNA虽然现在已有多种从环境样品中回收DNA的方法,但任何一种都无法保证能回收到所有的DNAo巳有证据证实,细胞回收程序中遗漏的某些微生物类群、DNA在分析之前的降解以及提取过程中并非所有类群的细胞都能同等有效地裂解,有些细胞甚至不能裂解,都可导致DNA提取的偏差卩川。

(3) PCR

把分子生物学技术应用于真菌群落研究的主要挑战之一是设计合适的PCR引物,已有引物分别针对真菌核糖体小亚基(18SrDNA)和内转录间隔区(ITS)设计扩增环境样DNAo为了探讨其特异性和广泛性,Anderson11121比较了不同的引物扩增真菌DNA 的能力,评价了不同引物扩增的偏见性。Smith""]指出由于设计过程中的一些问题,引物扩增具有一定的偏见性,而且不能区分联系密切的种类。由于引物对不同样品的扩增效率不同(由于引物的选择性退火以及模板的高级结构等因素的影响),经过多轮扩增后就会 产生很多误差,从而导致对rRNA基因自然丰度的估算会产生偏差114'I15,o

(4) 克隆的局限性

克隆步骤也存在倾向性,因为来自不同有机体的rRNA基因片段的克隆效率不可避免地存在差异,而且不同真菌其染色体上的rRNA基因的拷贝数并不一样,从而根据根据克隆的拷贝数估计种群丰度将导入随机误差I”】。克隆文库能够提供关于各个克隆分类地位的可靠的信息,但需要很长的实验周期和大量的实验材料,由于经费和时间的限制,实际匚作中对所有的克隆进行测序难以实现,只随机挑选部分克隆进行测序,但是最终只有在分析的克隆数目足够多的情况R才可以比较完整地认识种群组成的情况。因此,单-的克隆文库方法并不能完全描述样品中种群的多样性。

5)T-RFLP的局限性

T-RFLP技术也是基于PCR的分析技术,所以也具有PCR技术所具有的片面性。同T-RFLP技术本身的缺点是多种菌的酶切末端片段长度可能相同,造成对物种丰度的估计过低囚I由于ITS序列有保守区,在使用某一特异性限制性内切酶的条件下,若酶切位点落在微生物种群之间共有区域内,且此区域在ITS区中的位置相同时,各类群DNA序列差异就不会被反映出来,而表现为同一类群,而在使用另一种特异性限制性内切酶的情况下,若酶切位点没有落在群落中不同类群的共同区域,则可以将它们区别开来,反映了他们在系统进化中的关系。基于以上原因,在进行限制性酶切时,应该分别使用多种酶,并比较其结果。本实验只比较了Hpa II的酶切图谱,也许进一步使用其他限制性内切酶会得到更多的类群。

总之,任何技术有其自身的限制,特别当其被用于复杂微生物群落时更显现出单一技术的局限性。本实验结合3种方法,使我们能够比较逼近对“大型黏菌复合体”的真 菌群落的真实描述。


结论

1“大型黏菌复合体"中分离岀了 2种黏菌疣抱钙皮菌(Didyfnin/n verrucosporm ) 和扁垫双皮菌(Diderma deplanatum)

2利用平板培养方法、克隆文库序列分析和T-RFLP方法初步调查了“大型黏菌复合”真菌构成,包括枝顶弛霉属、青霉属、曲霉属、木霉属、丛赤壳属、赤霉属、枝泡属、葡萄状穗霉属、石座菌属和帚枝霉属。其中枝顶弛霉属、木霉属和青霉属占优势,TRFs显示“大型黏菌复合体”至少有18个类群的真菌。

总之,“大型黏菌复合体”的形成和化学成分是个复杂的问题,由于时间的限制本 文仅从微生物学的角度初歩描述了其黏菌和真菌的构成,但这些黏菌和真菌与“大型黏菌复合体”的形成的关系还有待于进一步深入研究。将来可从这些黏菌、霉菌和细菌的 代谢产物及相互之间的关系等进一步考察"大型黏菌复合体”的形成原因和化学成分。

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西北图二十.png

附录二黏菌照片

附录三真菌测序和alignment结果

附录四6个已知菌株和样品的基因扫描图

西北图二十一.png西北图二十二.png西北图二十二.png西北图二十四.png西北图二十五.png西北图二十六.png西北图二十七.png

西北1.png西北2.png西北3.png西北4.png西北5.png西北六.png

附录三真菌测序和alignment结果

(1)菌株F1

测得的菌株F1rDNAITS区序列如下。

TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCAGAGTGCCrrHGGCTCTCCAACCCACTGTGAACATACCTACGTT TCCCTCGGCGGGCTCAGCGCGTTGCGGTTCTGCCGCCTCGCGTCCGCCGGGGGCACCCAAACTCGAATTTATATCGTGT ATCTCTGAGGGGCGAAAGCCCGTAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCHGGCTCTGGCATCGATGAA GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAHGCGCCCG CCGGCACTCCGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGGGCCCACCCCTCGCGGGGAACGGGCCCGGCGT TGGGGACCGGAGGCCGCCCCGGCGGCACCCGCCCCCTAAATTCAGTGGCGGTCGCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAG CACACCTCGCACCGGAGAGCGGCACGGCCACGCCTCGAAACCCCCCAATTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAA TACCCGCTGAACTTAAGCATTATAAAAAGGGGGGGGGAAGAA

与最为相似的Accession number AF368810.1 Acremonium implicatum ITS 区序列(identities 99%, Score 1044 bits, expect value 0)的具体对齐结果(alignment)如下:>gb|AF368810.1| Acremonium implicatum 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence, Length=576

Score = 1044 bits (565), Expect = 0.0, Identities = 569/571 (99%),