太岁的抑菌作用及对小鼠免疫功能 影响的研究 硕士学位论文 MASTER DISSERTATION 论文题目:太岁的抑菌作用及对小鼠免疫功能影响的研究 学位类别： 医学硕士 学科专业: 药学
西南交通大学 太岁的抑菌作用及对小鼠免疫功能 影响的研究 级二O一四级名王禹 申请学位级别一医学硕士 业药学 指导老师喻凯教授 二零一七年五月 Classified Index: R96 U.D.C: 615 Southwest Jiaotong University Master Degree Thesis THE STUDY ON ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF TAISUI AND ITS EFFECT ON IMMUNOLOGICAL FUNCTION IN MICE Grade: 2014 Candidate: Wang Yu Academic Degree Applied for: Master of Medicine Speciality: Pharmacy Supervisor: Prof. Yu Kai May.2017 西南交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1. 保密口，在年解密后适用本授权书; 2-不保密/使用本授权书。 （请在以上方框内打“V”）
在关于太岁对动物免疫系统影响的研究几乎是空白的条件下，本人在学位论文《太岁对小鼠免疫功能的影响及抑菌作用的研究》中所做的主要工作或贡献如下： 1. 发现太岁有着很多的内生菌，本实验就其中三种菌进行了鉴定，其中一种是真菌Pseudeurotium ovale（假散囊菌属），另外两个是细菌分别是Beta proteobacterium MBIC3293 （0 变形菌属），bacterium YC-ZS S-LK J183 （微小杆菌属）；且这三种菌株是第一次从太岁中分离得出。抑菌实验显示太岁及其分离菌株的发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制作用不明显o 2. 发现太岁能够提高由环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的免疫功能。通过提高脾脏指数，使脾脏恢复至正常水平；通过促进抗体形成细胞的产生、T淋巴细胞的增值以及刺激巨噬细胞的吞噬作用，增强体液免疫、细胞免疫及非特异性免疫。 3. 发现太岁作用于体外巨噬细胞RAW264.7,能够促进其分泌NO、IL-1> IL-12；并且通过激活巨噬细胞RAW264.7,促进它的吞噬作用；同时太岁能降低LPS刺激后RAW264.7分泌NO、IL-1 > IL-12的水平，避免反应过强。 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明。本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。 学位论文作者签名：1 \% 摘要 对太岁进行菌种分离和分子鉴定，探索太岁的组成成分；观察太岁及其分离菌株发酵液的抑菌效果；探讨太岁对免疫低下小鼠的免疫功能，以及对体外培养的巨噬细胞RAW264.7的影响。 对太岁中的菌株进行分离纯化，提取所纯化的太岁分离菌株的基因组DNA,以之为模板，用16SrRNA、18S rRNA和TIS序列进行PCR扩增，通过序列对比对太岁菌种进行分子鉴定：观察太岁及其分离菌株发酵液的抑菌作用。 用环磷酰胺制备免疫低下小鼠模型，太岁溶液灌胃后，通过体征观察，脏器指数测定；用ELISA检测血清IL-2；用CCK-8检测淋巴细胞增值；用SRBC溶血实验测定抗体形成细胞数量；用中性红检测巨噬细胞吞噬能力，观察太岁对免疫低下小鼠的免疫功能影响。 用不同终浓度太岁处理静息和被LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7, CCK-8测定细胞的活性，用中性红测定细胞吞噬能力；用ELISA试剂盒测定细胞分泌的NO、IL-1、IL-12,观察太岁对巨噬细胞RAW264.7的影响。 从太岁中分离纯化出了三个菌株，通过鉴定，一种是真菌Pseudeurotium ovale｛假散囊菌属），另外两个是细菌分别是Beta proteobacterium MBIC3293 （p变形菌属），bacterium YC-ZS S-LK JI83 （微小杆菌属）。太岁及这三个菌株的发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制作用不明显。 在免疫低下小鼠实验中，模型组脾脏指数、T淋巴细胞增值、抗体形成细胞数量及巨噬细胞吞噬能力降低；与模型组比较，太岁组脾脏指数、T淋巴细胞增值、抗体形成细胞数量及巨噬细胞吞噬能力升高。 用不同终浓度太岁作用于静息的巨噬细胞RAW264.7,能够促进其分泌NO、IL-1、IL-12,促进其吞噬能力；LPS诱导后，太岁能抑制细胞分泌NO、IL-1、IL-12,抑制其吞噬能力。 太岁是一种复杂的生命体，其中包含有真菌Pseudeurotium cnWe（假散囊菌属）、细菌Betaproteobacterium MBIC3293 （p 变形菌属）和bacterium YC-ZS S-LK J183 （微小杆菌属）。本研究是第一次从太岁中分得这三个菌株。太岁及以上三个菌株的发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌无明显抑制作用。太岁能够提高免疫低下小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异性免疫功能。太岁对巨噬细胞RAW264.7 有明显的激活作用，同时能降低LPS对RAW264.7刺激作用。 关键词：抑菌；太岁；免疫调节；LPS （脂多糖）；小鼠；巨噬细胞RAW264.7 Study on antimicrobial activities of Taisui and its effects The objectives of this study were to isolate and molecular identity strains in Taisui samples, to determine their antimicrobial activities, and to investigate the effects of Taisui on immunity in immunosuppressed mice and macrophage RAW264.7 in vitro . The strains were isolated and purified from Taisui. Genomic DNA of the strains were isolated and used as the template to amplify 16S rRNA, 18S rRNA and ITS by PCR. Strain identification was performed by sequence alignment against NCBI Gen Bank. The antimicrobial activities of taisui and fermentation broths of the isolated microbes were determined in vitro. The immunosuppressional model mice were induced by cyclophosphamide. After intragastric administration with Taisui, immune function of the mice was investigated by general observation, organ index determination, and detection of IL-2, lymphocytic transfer testing, antibody forming cells, phagocytosis of macrophage. The quiescent and LPS-stimulated mouse macrophage RAW264.7 were treated with difierent concentrations of Taisui solution. The proliferation of RAW264.7 was tested with CCK-8. The phagocytic activity of RAW264.7 was tested by neutral red phagocytosis experiments. Moreover, the nitrous oxide (NO), interleukin-1 (IL-1), interleukin-12 (IL-12) in culture supernatants were measured by Enzyme-Linked Immunosorbent method (ELISA). Results： Pseudeurotium ovale、Beta proteobacterium MBIC3293 and bacterium YC-ZS S-LK J183 were found in Taisui. Taisui and fermentation broths of the isolated microbes showed hardly any inhibition on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albican. In experiment of immunosuppressional model mice, the spleen index, the number of antibody forming cells, macrophage phagocytosis, and lymphocyte proliferation had decreased in model group. These indicators of Taisui group were higher than those of model group. After the quiescent RAW264.7 was treated with different concentrations of Taisui solution, their secretions of NO, IL-1, IL-12, and phagocytic capacityit had increased. Taisui could inhibit the secretion of NO, IL-1, IL-12, and the phagocytic capacity of LPS-stimulated RAW264.7. It is the first time to isolate three microbes from taisui, Pseudeurotium ovale, Beta proteobacterium MBIC3293 and bacterium YC-ZS S-LK J183. Taisui and fermentation broths of the isolated microbes hadn' t obvious inhibition on Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Taisui could improve the cellular immune, humoral immunity, and non-specific immunity of immunosuppressed mice. Taisui could markedly activate the mouse macrophages RAW264.7. Keywords: Antimicrobial; Taisui; immune regulation; lipopolysaccharide(LPS); mice; macrophages RAW264.7 3.2.1实验动物18 3.2.3仪器与设备19 3.2.4实验方法19 3.3.2体液免疫测定20 3.6小结28 4.2.3仪器与设备29 4.2.5实验方法30 4.3.3 N0含量、IL-1含量和IL-12含量的测定34 缩略词47 n页 攻读硕士学位期间发表的论文48 1.1太岁的研究近况 1.1.1太岁的概述 太岁又称为肉灵芝，主要存在于地下或者生活在水中，是一种极其珍贵的大型复合黏菌生物。太岁表面凹凸不平，呈淡黄色，内部呈现白色，纤维状，质地非常柔软而且韧性极好⑴。目前，关于太岁的文献非常的稀少，主要是太岁的一些新闻报道和 民间传说。太岁的由来已久，几千年前就已经有典籍记载或者民间的传说。在明代医 学家李时珍的《本草纲目》中提到，“肉芝状如肉，乃生物也，白者如截肪，黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也”。《神农本草经》也有记载到“肉灵芝，无毒，补中、益精气、久服轻身不老”。两者的共同之处都是说起功效。 1.1.2太岁的研究进展 关于太岁的研究，国外未见有报道；国内只有极少的研究报道。朱春玉【2】等对太岁进行了生物学组分的分析，发现太岁含水量高达90%以上，粗多糖的含量次之，还有核酸、钙、铁等物质的生物。印证了太岁有一定的营养价值。郑科研⑴等也对太岁进行了分析研究，同样证实了其含有多糖成分。董兆麟教授实验室对太岁的内生菌进行了分离鉴定，分离出了35株细菌和17株真菌，其中。-变形菌属是太岁中的优势菌 株。 1.2免疫学研究近况 1.2.1免疫学概况 在人类与病魔作斗争的过程中逐渐发展起来了一门学科就是免疫学。随着医学的不断发展，人们发现免疫调节与疾病的发生密切相关⑶，而且在治疗和预防传染疾病、 感染、抗肿瘤方面都有卓越的表现。免疫学的根本问题当然还是机体的“自我”和“非 我”的识别，同时促进免疫细胞的分化，发育，活化及代谢等维持机体的健康平衡。 特异性免疫和非特异性免疫组成了机体的免疫系统。当前免疫学研究包含有三大版 块，其一是基础免疫学，其二是临床免疫学研究，其三是免疫学技术的研发。 1.2.2淋巴细胞的免疫应答 脾脏是机体主要的免疫器官之一，主要由T、B淋巴细胞组成。当外源抗原刺激淋巴细胞后，淋巴细便会增值分化，并分泌相应的抗体及细胞因子参与免疫应答〔4】，所以淋巴细胞是机体重要的效应细胞。研究的热点主要集中在增强宿主抵御病毒的免疫细胞上面，这些细胞能够分泌促进或者抑制免疫的细胞因子【5】。 T细胞主要在胸腺中成熟，常常在二级淋巴器官或组织中辅助B细胞发生免疫应答。T细胞包括T辅助细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)两大类。其中Th细胞又有两种类型：Thl、Th2,表达CD4。CD4+T细胞在由病原体和肿瘤细胞的引起的免疫应答反应中十分的重要，能够促进其他的免疫细胞释放细胞因子参与调节⑹。Thb Th2, Th9, Thl7, Th22,滤泡辅助T细胞(IM)以及调控T细胞(Treg)都属于CD4+细胞亚群【7, 8】。在HIV感染，抗肿瘤免疫，超敏反应，自身免疫病，器官移植，免疫耐受等方面CD4+T细胞都占有重要地位WL其中CD4+T细胞分泌的细胞因子IL-4在甘露聚糖诱导的免疫调节中是很重要的〔⑵，而且IL-12p40, IL-10, IFN-y也会诱导效应细胞产生CD8；所以Th2细胞主要参与体液调节。Thl主要参与体液调节，能分泌IL-2、IL-12s TNF-a因子。所以维持Thl和Th2细胞亚群的平衡有助于免疫相关疾病的治疗冋。 B细胞产生并成熟于骨髓中，有外源抗原刺激时，会移动到二级淋巴组织中发生免疫应答。B细胞有B1细胞和B2细胞两大类组成。其中B1细胞不依赖T细胞；B2 细胞则会在Thl细胞分泌IL-2、IL-4、IFN-丫等细胞因子的作用下被激活并产生抗体卩句。B细胞在LPS的诱导下，会使共刺激分子表达上调，分泌IL-10、TNF等细胞因子，使B细胞的抗原提呈能力增强〔I%在T细胞的辅助下而促进免疫应答。 1.2.3巨噬细胞的免疫应答 巨噬细胞作为免疫效应细胞具有多种功能3】，可通过加工递呈抗原及协同T细胞调节获得性免疫，同时也是宿主天然免疫防御阵线的重要成员卩吃巨噬细胞是从单核细胞分化而来的，主要是胚胎或者骨髓中肝细胞分化得来[,8J9]o巨噬细胞受到异物刺激时会分泌很多的细胞因子来维持内环境的稳定。巨噬细胞细胞在先天以及获得性免疫、伤口愈合、炎症中扮演着关键的角色〔2。】。巨噬细胞通过细胞表面和胞质受体来识别并吞噬，机体内的坏死、损伤的细胞或者是组织以及一些外来的异物⑵】。脂多糖 (LPS)和干扰素-丫 (IFN-Y)就是常见的体外诱导物，LPS广泛的存在于革兰氏阴性菌的细胞壁中，常通过结合TLR4蛋白和辅助蛋白CD14【22〕，从而激活调节蛋白MyD88, 促使巨噬细胞向Ml型分化，同时这一结果的产生会使激活主要组织相容性复合体II (MHCII)和共刺激分子B7分泌IL-1, IL-12以及TNF-a,从而参与免疫调节。如图
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3本研究的目的及意义 关于太岁究竟是什么生物的研究还极其有限。本研究试图对太岁中的微生物进行一定的分离鉴定，为太岁的本质研究提供一定的依据。关于太岁的抑菌作用和免疫功能影响的研究还几乎为空白。增强免疫是现在研究的热点之一，可以通过提高机体的免疫力促使机体抵抗病毒、抵抗过敏、抵抗疲劳以及延缓衰老等。有文献显示，多糖对巨噬细胞、T淋巴细胞以及NK细胞都有促进作用，它会作用于细胞的表面引起一些免疫反应SI,如刺激巨噬细胞分泌NO、TNF-a、IL-1等控制机体的免疫活动仅可。植物多糖不仅仅在免疫方面，而且在抗肿瘤和抗炎方面也发挥着重要作用"I。太岁中也有多糖以及核酸等的存在，所以就顺着这条思路，本研究拟探索太岁对免疫功能的影响，以及它的抑菌作用，为太岁的开发奠定理论基础。 第二章太岁的鉴定及抑菌作用研究 2.1引言 动物和植物都拥有各自复杂的形态学，种属分类时形态学便发挥了重要作用。与之相似的，微生物的结构如：形状、大小、鞭毛以及生化特征等也常用于微生物的鉴定及分类"I。基于细菌间的水平基因转移，这种分类的方法并不是十分可靠的，所以一种DNA序列分析方法〔291,由于基因片段保守且稳定为研究细菌的种属提供了更可靠的证据。其中16SrDNA作为核心基因目叫更是常用于原核生物的分类⑶】、鉴定、 菌落形态、多样性分析［32,33］。 目前抑菌的主要手段是抗生素及一些化学药品的使用，随着抗药和耐药型超级细菌的出现【34),很多国家出台了相关规定限制抗生素类的使用。抗生素替代品的研究则吸引了不少学者的目光，其中微生态制剂、酶制剂、中草药等产品虽然显示出了抑菌作用〔351,但是实际生产中由于资金及效果的影响并未得到广泛应用，因此从自然界中寻找天然抗菌物质为抑菌研发提供了新的思路【36】。 关于太岁的研究目前还比较少，林涧等【3刀从太岁样品中分离得到粘质红酵母为其优势菌种，而戴璐【38］从太岁中分离得到2株黏菌和18个类群的真菌，王欣则从太岁中分离出35株细菌和1株粘菌；故对太岁身份仍旧没有统一的规定，所以本章将对太岁所含菌株进行分离和鉴定。王欣【391提到太岁中分离得到一株强抑菌功能的菌株，然后关于其抑菌作用再无其他文献提及，所以本章还将研充太岁及其分离所得菌株发酵液对常见细菌、真菌的抑制作用，为其未来的开发利用奠定基础。 2.2材料与方法 2.2.1实验材料与供试菌株 1. 太岁样本：2014年夏，于新疆石河子市一条无名小河的河床釆得，由四川省归朴太岁生物科技有限公司提供。 2. 菌株：大肠埃希氏菌(Esc/?erjc/n，coli)、金黄色葡萄杆菌(Sgp方jVoccocus aureus Rosenbach)、白色念球菌(Monilia albican)；菌株来自西南交通大学生命学院李学如老师实验室赠送。 2.2.2实验试剤
2.2.4实验方法 2.2.4.1菌种的鉴定 1 .太岁样本表面消毒〔3刀将浸泡在自来水中的太岁切取两块，每块约3 g左右。将其置于75%酒精中，然后将其转移到超净工作台内，75%酒精继续浸泡5 min,取出并转移到无菌培养皿中用无菌水冲洗3~4次【4。】，并回收最后一次冲洗液备用。 2. 太岁中菌种的分离用灭菌的剪刀将已经表面消毒的太岁剪成小碎块，用镇子将太岁小碎块放置于土豆固体培养基上，将培养皿转移到30°C恒温培养箱，直到长出菌落为止。选择不同形态特征菌落，各自划平板，直到有单菌落出现为止。将分离到的类似真菌单菌落接种到有50 mL 土豆液体培养基的容量为250 mL的锥形瓶中，30°C 静置培养48 h并保存菌种。类似细菌的单菌落则接种到肉汤液体培养中，200 r/min, 37C摇瓶培养12 h并保存菌种。 空白对照设置【糾：取100卩L上述冲洗液，均匀涂布于土豆培养基上，检测太岁表面消毒的效果。 3. 形态特征的鉴定菌株在固体培养基中30C培养2~7d后观察菌落的生长形态，于显微镜下观察其显微特征。 4. 分子生物学鉴定：16SrRNA序列对细菌菌种的鉴定卩刀如下： ⑴菌种基因组DNA的提取 提取细菌DNA按照DP3O2试剂盒说明操作。 (2) 基因组扩增 1) 、菌种鉴定通用引物：Forward Primer： 5'- AGTTTGATCMTGGCTCAG-35 Reverse Primer： 5'- GGT1ACCTTGTIACGACTF3, 2) 、PCR反应体系 T5Mix 25 gL PR(10P) 1 卩L PR(10P) 1 卩L Gdna1 卩L dH20 22 卩L 3) 、PCR扩增条件 94°C热启动变性5 min； 98°C 变性10 s；］ 55 °C 退火15 s： I 35cycles； 72°C 延伸15 s： J 72°C 延伸5 min 4 °C hold 4) 、凝胶电泳 1%琼脂糖电泳，150V、100 mA20 mino 5) 、PCR产物纯化 PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化PCR产物用引物直接测 序。 6) 、16SrRNA序列测序及同源性比较：纯化后的PCR产物，由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成产物测序。将测序结果输入美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information. NCBI) GenBank 数据库中进行同源性检索，根据同源性确定菌株的种属。 18S rRNA序列对真菌生物学鉴定： (1) 菌种基因组DNA的提取 提取真菌DNA按照DP302试剂盒说明操作。 (2) 基因组扩增 ])、菌种鉴定通用引物：Forward Primer：須-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3， Reverse Primer： 55- GGAAGTAAAAGTCGTAACA-3， 其他操作同细菌分子生物学鉴定。 2.2.4.2抑菌作用的研究 1. 培养基的制备 (1) 肉汤培养基取9g培养基粉末加入500mL去离子水,121 °C 25 min,即可。肉汤固体培养基则需要再加入15 g琼脂。 (2) 土豆培养基去皮土豆100 g切片，沸水煮15 min,过滤使用4层纱布，定容至500 mL,加入10g葡萄糖121C 30 min,即可。土豆固体培养基则需要再加15 g 琼脂。 2. 受试菌的制备 (1) 细菌类取出冻存的大肠埃希氏菌，室温解冻后放入超净工作台，用接菌环挑取适量的菌液划线接种在肉汤固体培养基上，将接入菌的培养皿转入37C恒温培养箱中培养12h,便会长岀大肠埃希氏菌的菌落，选取其中某一个单菌落用接菌环将其接入无菌的肉汤液体培养基内，200r/min 37C培养12h即可。活化金黄色葡萄球菌的步骤同大肠杆菌活化步骤一致。 (2) 真菌类取出冻存的白色念球菌，室温解冻后放入超净工作台，用接菌环挑取适量的菌液划线接种在土豆固体培养基上，将接有白念的培养皿转入30C恒温培养箱中培养24 h,便会长岀白色念球菌的菌落，选取其中某一个单菌落用接菌环将其接入无菌的土豆液体培养基内，180r/min 30°C培养24h即可。 3. 样品的制备 (1) 水溶太岁称取太岁2 g进行表面消毒操作同2.2.4.1 1后，加入无菌水，水浴80°C加热30 min,太岁完全溶解后使太岁溶液终浓度为120mg/mL,此浓度为太岁溶解的最大浓度。使用前用0.22 gm无菌过滤器过滤除菌。 (2) DMSO溶太岁制备同水溶太岁步骤一致，改换溶剂为DMSO。分一部用使用时培养基溶液稀释10倍，获得终浓度为120 mg/mL和12mg/ml的太岁DMSO溶液。 (3) 分离菌的发酵液取1 mL混匀的菌液,转入离心管内，8000r/min离心10min, 取上清即可。 (4) 氯霉素溶液取100 hL氯霉素溶液，培养基溶液稀释10倍后即可。 (5) 克霉哩溶液取100 gL克霉哩溶液，培养基溶液稀释10倍后即可。 4. 抑菌试验 使用牛津杯法测定，观察抑菌圈的大小。无菌条件下掬平板并冷凝，用涂布法将受试菌涂抹均匀，然后将牛津杯轻轻放置在平板表面，无菌条件下用移液器取200 jxL 太岁溶液和阳性药液分别加入不同的牛津杯，将盛有菌和太岁溶液的培养皿置于4°C 冰箱过夜，让太岁在培养皿内充分的扩散，次日再放入37C度恒温箱约继续培养12 h0 然后观察抑菌圈大小。 2.3结果与分析 2.3.1菌种分离鉴定 2.3.1.1形态特征鉴定 1.太岁表面消毒结果 无菌条件下，将回收的冲洗液均匀涂布在肉汤和土豆固体培养基上，37C培养12 h后，无任何细菌生长：30°C培养土豆固体培养基48h后，也无任何真菌生长；说明太岁的表面消毒成功，分离得到的菌属于太岁的内生菌。 2.1号菌形态鉴定 1号菌种平板划线，30C培养48h后，在平板上长出菌落。菌落呈圆形扩散，逐渐长出丝状，菌丝呈白色；培养5d后气生菌丝仍旧呈白色，贴于培养基上的菌丝则逐渐发黑。400倍显微镜下观察，菌丝体中空，所以初步断定1号菌可能是真菌。
3.2号菌形态鉴定 2号菌种平板划线培养24 h后，在平板上长出待测菌落。2号菌生长速度比较快, 菌落比较稀疏，呈乳白色，不透明，并产生一种刺鼻的味道，菌落表面干燥，质地偏硬；于400倍显微镜下观察，菌体呈椭圆形，番红染色后菌体呈现红色，初步断定2 号菌种是革兰氏阴性细菌，见图2-2。
图2-2 2号菌形态特征图 4.3号菌形态鉴定 3号菌种平板划线培养12 h后，在平板上长出待测菌落。菌落呈圆形，菌落周围整齐，最开始呈乳白色，继续培养24 h后菌落逐渐变成黄色，表面光滑湿润；于400 倍显微镜下观察，菌体呈杆状并且被结晶紫染成紫色，初步断定3号菌种是革兰氏阳性菌，见图2-3所示。
2.3.1.2分子生物学鉴定 不论是原核还是真核生物，都分布有核糖体。由于核糖体RNA拥有高度的保守序列区域，同一物种生物rRNA序列差异很小，同时又有适当的进化速度，所以rRNA 作为常用分子标记，常常它用于菌株的分类鉴定〔4”。 通过菌种分离技术，本研究取其中的三株优势菌分别提取其基因组DNA后，用PCR扩增获得基因组16S rRNA、18S rRNA基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测，与Maker 比较推断2号和3号细菌的16SrRNA基因片段的大小均在1500-1700 bp左右，如图2-4所示。1号真菌的18S rRNA基因片段的大小均在500 bp左右，如图2-5所示。
1. 1号菌的分子生物学鉴定 将扩增的18SrRNA基因片纯化后，送到成都撃科梓熙生物技术有限公司进行测序，得到的基因序列图2-6所示。 TGATCCGAGGTCACCTGAGAAAATTGGGGGTCGCTGGCAAGCACGC ACCCGGGCCTCCAAAGCGAGAAGAATTACTACGCTTGAAGCCGGAT GGCACCGCCACTGATTTTAAGGCCTGCCGGGACCGGCAGAGCCCAA TACCAAGCAGAGCTTGAGGGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCATGC CCCCCGGMTACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAG.MTCGATGA TTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGT TCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAA CTATTATATAGTACTCAGACAATATGMCAGACAGAGTTTTAGGTC CCCTGGCGGGCGCTGACCAGCCAGAGCCGGTGGTCCGAGGACGGGC CCGCCAAAGCAACAAAGGTATAATAAACAAAGGGTGGGAGGTATAC CCCGGAGGGCAACGTCTCTTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTA CGGAAACCTTGTTACGTTTT 图2-6 1号菌株18S rRNA基因片段的测序结果 将测序获得的基因序列输入美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的BLAST程序，进行序列相似性分析。根据发育树上不同菌种与1号菌株的距离远近断定，1号菌是Pseudeurotium ovale(卵圆假散囊菌)。它的18S rRNA基因序列与数据库中Pseudeurotium ovale等菌的序列相似性达到99%,显示其具有同源性，根据序列构建系统进化树，如图2-7所示。 Pseudeurotium bakeri RscudcurotJum sp. F09-T5-1 Uncultured Pseudeurotium Pscudcurotiurn hy^rophilum Fungal endophyte Pseudeurotium hakeri Pseudeurotium bakeri Unknown 1 ^seudeurotiuni ovale var. ovale o.ooio 图2.7根据1号菌18SrRNA全序列构建的系统发育树 2. 2号菌的分子生物学鉴定 操作同2.3.1.2 1号菌鉴定步骤，2号菌得到的基因序列如图2-8所示。 CCTGGCGACGAGTGGCGMCGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTTGTGGGGG ATAACTGCTCGAAAGAGCAGCTMTACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGAT CGCAAGACCTCGCGCAATTGGAGCGGCCGATATCAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAA GGCTCACCAAGCCAACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGACG CAAGTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTT nGTCAGGGAAGAAACGCTCTGGGTTMTACCTCGGGGTAATGACGGTACCTGAAGAA TAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAA TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTATGCAAGACAGAGGTGAAATCC CCGGGCTCAACCTGGGAACTGCCTTTGTGACTGCATAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGG ATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGA AGGCAATCCCCTGGACCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCMCTGGTTGTTGGGAGGGTTT CTTCTCAGTMCGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGG TTGAAACTCiUAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTT*UTT CGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCAGGAATCCTGCAGAGATGT GGGAGTGCTCGAAAGAGAACCTGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGA AAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGAC^ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAG GTCATCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGGACAGAGGG CTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTMTCCCAGAAACCCGGTCGTAGTCCGGATCGCAGT CTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCTTGCCGCGG TGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGC CAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATACC 将2号菌株16S rRNA基因片用BLAST程序，进行序列相似性分析。得到如图2-9所示的发育树。2号菌与Betaproteobacterium（^变形菌属细菌）和Pelomonas sp.T52 的序列相似达到99%,表明他们有同源性，2号菌距离Betaproteobacterium最近，所以2号菌则认定为Betaproteobacterium MBIC3293fp变形菌属细菌）。这一结果与王欣[39】分离出的菌株均属于。变形菌属细菌，但是属于不同的种。 Mitsuaria chitosanitabida Rose at eles depolynierans Mitsuaria sp. CR 6-14 Pelomonas sp. T52 unknown .»beta proteobacterium MBIC3293 0.0010 图2.9根据2号菌16S rRNA全序列构建的系统发育树 3. 3号菌分析生物学鉴定 操作同2.3.1.2 1号菌鉴定步骤，3号菌得到的基因序列如图2-10所示。 TCGACGGAACCCTTCGGGGGGAAGTCGACGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAC GTAAAGAACCTGCCCTCAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTMTACCGGAT GGGTCATCGGACCGCAGGGTCCGAGGATGAAAGGCGCTTCGGCGTCGCCTGGGGATGG CTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAG CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGT GAACGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCA GGCMTGGCGGCACCTTGACGGTACCTTGCGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCG CGCAGGCGGCCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATT GGAAACTGGGAGGCTTGAGTATAGGAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAA ATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGCCTATAACTGA CGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC GTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGAAGCTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTAC CAACTCTTGACATCCCCCTGACCGGTACAGAGATGTACCTTCCCCTTCGGGGGCAGGG GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGAGA CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG AGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTG GAGCCAATCCCAGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATG MGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTC TTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAA CCTTAGGGAGCCAGCCGCC 将3号菌株16S rRNA基因片用BLAST程序，进行序列相似性分析。得到如图2-11所示的发育树。根据系统发育树发现3号菌与Exiquobacterium 5p.DH-l-8-2和Exiquobacterium homlense等菌的序列相似达到99%;表明他们有同源性，3号菌初步认定为bacterium YC-ZS S-LKJ183（微小杆菌属）。有研究者认为，Exiquobacterium属细菌能够除去污水中的铭〔彳，也许这就是太岁能够净化并且在污水中生活的原因。 Exiquobacterium aurantiacum Exiquobacterium aurantiacum Exiguobacterium sp. DH-1-8-2 bacterium YC-ZSS-LKJ183 unknown Exiguobacterium homiense 0.00020 图2-11根据3号菌16S rRNA全序列构建的系统发育树 2.3.2抑菌作用研究 2.3.2.1对大肠杆菌的抑制效果 大肠杆菌作为革兰氏阴性菌的代表，观察水溶太岁、DMSO溶太岁、1号菌发酵 液、2号菌发酵液、3号菌发酵液的抑菌作用。实验结果显示，除了阳性组外，其余 均无抑制作用，如图2-11所示。
图2-11太岁对大肠杆菌的抑制效果
2.4小结 1. 通过对分离得到的菌落的外观形态观察与生理生化分析，同时结合16SrRNA 鉴定的方法，构建系统发育树，初步确定1号菌株为汕m ova/e（假散囊菌属），2号菌则认定为Beta proteobacterium MBIC3293 （p变形菌属），3号菌初步认定为bacterium YC-ZS S-LK J183 （微小杆菌属）;且这三种菌株是第一次从太岁中分离得出。 2. 通过抑菌实验发现太岁及其分离菌发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌无明显抑制作用。 第三章太岁对小鼠免疫功能的影响 3.1引言 随着生活水平的提高，健康得到人们对其更多的青睐，免疫学是在人类与疾病斗争中逐渐完善得到发展的。脾脏和胸腺作为最大的两大免疫器官，在其中存在于脾细胞的淋巴细胞在是目前免疫学研究的重点。如：CD4+T细胞在免疫系统中的重要性众所周知，因为它能分化成为Thl, Th2, Th 17以及调控T细胞Ml,而这些细胞它们都各自发挥着不同的效应。其中Th细胞在激活宿主抵御感染以及CD8+淋巴细胞占有重要地位卩°】。还有文献提到希望通过免疫提高治疗肿瘤〔46】、感染、传染性疾病等。 本部分实验利用环磷酰胺制造免疫低下小鼠模型，通过给予水溶太岁液进行治疗，最后对免疫低下小鼠血清体中的IL-2浓度等生化指标进行测定，淋巴细胞转化实验中用CCK-8测定免疫低下小鼠淋巴细胞转化中增殖效果、用中性红生理盐水溶液测定巨噬细胞吞噬能力，SRBC测定抗体形成细胞数量，以此来评估太岁对免疫低下小鼠免疫功能的影响。 3.2材料与方法 3.2.1实验材料与实验动物 1.太岁样本：2014年夏，于新疆石河子市一条无名小河的河床采得，由四川省归朴太岁生物科技有限公司提供。 2.48 R清洁级KM小鼠，雌雄各半，体重20±2g,由成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2013-24。 3.2.2实验试剂
3.2.4实验方法 3.2.4.1动物分组与给药 实验中选用健康正常昆明种小鼠48只，为了适应环境先饲养3d,然后随机分为4组:空白对照组、模型组（生理盐水）、阳性对照组（盐酸左旋咪哩40mg/kg）、太岁组（水溶太岁120mg/mL,制备操作同2.2A.2 3）,每组12只。太岁组小鼠每天灌胃给药0.1 mL/10g,早晚各1次，空白对照组和模型组用等体积的0.9%生理盐水灌胃，连续10 d：第lid观察各项指标。其中除空白对照组外其余3组分别于给药第2d后腹腔注射80 mg«kg-1新配制的环磷酰胺"，连续3d,制备免疫功能低下的小鼠模型网。3.2.4.2小鼠体征等一般情况观察 实验期间，注意观察并记录小鼠的情况，尤其是制备模型之后，主要观察记录体重，饮食，饮水，发质情况等。 3.3太岁对小鼠免疫功能的测定 3.3.1细胞免疫测定 3.3.1.1脾细胞的制备〔49网 最后一次给药后，所有小鼠都禁食16h。第二天，对每组小鼠进行称重并记录。然后用镶子迅速摘除小鼠眼球，为了方便收集小鼠血液，将小鼠倒立，取1.5 mL离心管迅速收集全血，收集结束后，将离心管倾斜放置，等全血于于室温中凝固后（约0.5-2 h后），离心2500 r/min, 5 min,移液器收集上清液，并转入干净的离心管内，放置4C冰箱备用。将放完血的小鼠浸泡在75%酒精中约5 min,然后将小鼠放在无菌操作台用镣子轻轻提起腹部皮肤，小剪刀缓缓破开腹腔取出脾脏，并将脾脏放入无菌离心管并重量，冰浴上研磨脾脏，用RPMI1640基础培养基冲洗并在70 pm细胞过滤器过滤脾细胞，离心管收集，1000 r/min , 5 min弃上清。加入5倍体积的红细胞裂解液，移液器使细胞和裂解液充分混匀，并静置5 min,最后加入无血清RPMI-1640 培养基停止裂解，1000 r/min, 5 min,保留细胞沉淀。用3倍体积的无血清RPMI-1640 培养基清洗，1000 r/min, 5 min弃上清，重复三次；加入20% FCS RPMI-1640培养基调整细胞密度，血球计数板计数。 3.3.1.2 T细胞增殖实验〔51】 细胞终密度为IX 107个/mL,接入96孔板，100卩L/孔，每组设置3个重复。加入终浓度5 gg/mL Con A, 50卩L/孔，同时设不加Con A（20% FCS RPMI-1640培养基50 |iL/孔）阴性对照，放入37C、5% CO2恒温箱孵育，44 h后，每孔加入15 |1L CCK-8（CCK-8的加入量为总体积的1/10）,继续培养4 h测OD 450 nm处。淋巴细胞增值公式【52】：淋巴细胞增殖率=实验组OD值-对照组OD值 3.3.1.3B细胞增殖实验 步骤同3.3.1.2加入终浓度5 gg/mL LPS,. 50卩L/孔，同时设不加LPS （20% FCS RPMI-1640培养基50卩L/孔）阴性对照，放入37°C, 5%CO2恒温箱孵育，44h后，每孔加入15 pL CCK-8（CCK-8的加入量为总体积的1/10）,继续培养4 h测OD 450 nm 处。 3.3.2.1绵羊红细胞的制备 健康抗凝绵羊全血，由成都达硕生物科技有限公司提供。将羊血转入15 mL无菌离心管内，加入PBS轻轻吹打混匀，2000 r/min离心5 min,弃上清，重复洗涤3次卩刃。最后加入5倍体积阿氏液混匀，置于4笆冰箱保存备用。使用前将洗涤的红细胞做成5%的细胞液【刈，放置于4C冰箱保存备用。 33.2.2豚鼠血清的制备 健康豚鼠，由成都达硕生物科技有限公司提供。釆用心脏取血法［列，注射器直接插入心脏抽取全血，然后将全血转移到无抗凝剂的10 mL离心管中，将其静置室温0.5-2 h后，3000 r/min, 5 min,得到上清即为血清，将上清转入干净离心管内，分装备用放入-80C冰箱。 3.3.2.3对抗体生成细胞的影响〔56】 小鼠灌胃给药到第5 d时，向小鼠腹腔注射0.2 mL 5% SRBC (v/v)致敏，同时设定不致敏对照小鼠，免疫5 d后，脱颈椎处死小鼠。按操作3.3.1.1脾细胞的制备脾细胞悬液，最后调整终浓度为1x107个/mL。在冰浴中，向2mL离心管中依次加入脾细胞悬液、0.4%SRBC(v/v)、10%豚鼠血清(v/p)各0.5 mL并充分混匀，对照管则以RPMI-1640培养基代替脾细胞悬液，其他的加样物相同，加样完成后，将密封的离心管放入37C水浴60 min,在冰浴环境终止反应，3000 r/min, 5 min,吸取上清液于450 urn处测吸光值。 3.3.3非特异性免疫测定 3.3.3.1淀粉肉汤的制备 参考文献〔切制备5%淀粉肉汤液：蒸馅水WOmL,加入牛肉膏0.3 g,蛋白豚1 g, 氯化钠0.5 g,可溶性淀粉5 g,加热溶解混匀，高压灭菌，4°C冰箱保存。 333.2小鼠巨噬细胞吞噬功能测定 1. 腹腔巨噬细胞的提取 根据文献〔58】实验结束前3d,每天向小白鼠腹腔注射5%淀粉肉汤液1 mL后轻柔腹部，以刺激小白鼠腹腔巨噬细胞渗出；末次注射后，禁食不禁水12h。颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡消毒2-3 min,腹腔内注射无血清RPMI-1640培养液5mL,无菌收集腹腔液。 2. 巨噬细胞的纯化 1000 r/min离心10 min收集细胞，用含10% FCS的RPMI-1640培养细胞，以每孔1 mL细胞悬液接种于24孔培养板，置培养箱中，经5% CO2, 37C培养4 h。弃上清液，用PBS轻轻洗去未贴壁细胞，剩余的细胞则为腹腔巨噬细胞。调整细胞密度2X106个/mL,每孔加培养液ImL,继续培养。 3. 吞噬中性红反应 巨噬细胞经37 °C孵育24 h后，每孔加入0.05%中性红生理盐水液ImL,继续培养30 min。细胞经PBS洗涤3遍，每孔加入细胞溶解液(乙酸：无水乙醇=50 : 50)1 mL, 4°C放置4h。到待细胞完全溶解后，540 nm处用酶标仪测各孔吸光度。以OD 值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。 3.3.4免疫器官质量的测定 根据样本制备过程中所记录的小鼠体重及脾脏的重量，计算脾脏指数。计算方法如下： 脏器指数(g/100g)=[脏器重量(g)/体重(g)]xioo 3.3.5太岁对免疫低下小鼠相关生化指标的检测 根据相关试剂盒的说明书分别在450 nm处测定血清吸光度，最后带入标准曲线算出血清中IL-2浓度。 3.3.6统计学处理 统计分析釆用GraphPad Prism 6软件，数据用Mean±SEM表示，用one-way ANOVA进行显著性分析。PV0.05被认为有差异，P<0.01被认为有显著差异。 3.4结果与分析 3.4.1 KM小鼠生长状况的观察与脏器扌旨数的测定 小鼠注射环磷酰胺之后，出空白组外其他组小鼠均岀现了毛发疏松、体重下降等症状；灌胃给药之后，太岁组和阳性组小鼠体重逐渐的增长恢复至空白组小鼠的体重值，与空白组比较模型组小鼠的体重却增长缓慢，空白组小鼠体重持续增长。脾脏指数如表3-3所示，与空白组相比较，模型组体重显著下降(FV0.01),说明造模成功；与模型组比较，太岁组和阳性组显著上升(PV0.01),说明太岁对小鼠的脾脏有保护作用。脾脏指数是免疫功能检测的指标之一31。 表3-3太岁对免疫低下小鼠的脏器指数和体重影响
小鼠抗体形成细胞数量的测定 由图3-5可知，与空白组比较，模型组的抗体形成细胞数量显著减少(pvo.oi), 说明免疫低下小鼠分泌抗体能力较低，造模成功；与模型组比较，太岁组的抗体形成细胞数量显著增加(P<0.01),说明太岁能够促进抗体形成，参与体液免疫从而提升机体免疫力。与模型组比较，阳性组的抗体形成细胞数量显著增加(PV0.01),说明盐酸左旋咪哩能提升机体免疫力。 表3-6太岁对免疫低下小鼠抗体形成细胞数量的影响
图3-6太岁对免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响 (注：vs 空白组，"尸<0.01, *P<0.05； vs 模型组，**P<0.01, *P<0.05» 下同。) 3.5讨论 免疫试验中，常会使用到免疫低下模型来判断药物对机体的免疫能力检测；常用免疫低下模型的药物：环磷酰胺、氢化可的松、地塞米松等，其中环磷酰胺最为常用l6，1o环磷酰胺属于烷化剂类，它能破坏DNA结构【62],阻断细胞进行有丝分裂，属于较强的免疫抑制剂。所以本实验选用了环磷酰胺制备小鼠免疫低下模型。机体的内环境总是处于一种动态平衡，对机体的健康起着重要影响。免疫系统在内环境稳定中也有发挥着重要作用。脾脏和胸腺是机体的主要免疫器官，T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞等免疫细胞以及包白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)和溶菌酶等免疫因子【63】这三大板块组成了机体的免疫系统。实验结果显示，模型组相比较于空白组，脾脏指数显著降低，说明环磷酰胺注射后，会对脾脏造成影响，使得小鼠的免疫力下降，同时也说明造模是成功的；通过给免疫低下小鼠灌胃太岁溶液后，小鼠的脾脏指数相比较于模型组有显著上升，说明太岁可以通过脾脏等组织器官参与调解机体的免疫功能。IL-2作为一种T淋巴细胞生长因子，主要是活化的Thl细胞产生的【句。研究表明IL-2在体内还有限制T细胞反应，促进自身耐受形成的作用〔65,佝。实验结果显示，模型组血清中IL-2浓度显著高于空白组，这一结果与现有文献报道不一致，我们猜测可能是由于CTX杀死了很多的白细胞，使得白细胞数量减少，因而反射性地促使机体产生更多IL-2来参与免疫调节，以维持机体的平衡，但即使这样模型组的淋巴细胞数量还是明显降低，所以这还不能完全解释造成这种结果的原因。接下来准备进一步进行实验来探索形成这一结果的原因。太岁组和阳性组血清中IL-2浓度恢复至了空白组了水平。LPS（脂多糖）是B细胞的激活剂，促进B细胞进行有丝分裂, B细胞又是抗体分泌细胞，在体液免疫中发挥重要作用〔6刀。ConA是常用的T淋巴细胞的激活剂〔6气T细胞不仅在激活和维持机体抵御感染方面发挥着极为重要的作用，同时也在清除癌细胞方面有着举足轻重的地位Ml。Th细胞是许多自身免疫病的发病机理所在，所以有时候局部感染后会导致整个组织或者器官的损坏〔68】；而且还参与B 细胞的活化。实验结果显示，虽然太岁并没有明显的促进B淋巴细胞增值，但是却促进了T淋巴细胞的增值，促使T细胞增值分泌细胞因子，参与了机体的细胞免疫过程。T细胞分泌的细胞因子多数可以作为激活B淋巴细胞的第二信使，然后激活整个免疫应答。抗体形成细胞数量测定中，关键点在于SRBC首次注射到小鼠体内，促使免疫细胞分化为记忆细胞，当SRBC再次刺激时，免疫细胞就会分泌抗SRBC抗体来抵御异物SRBC。实验结果显示，与空白组比较，模型组抗体形成细胞数量显著下降，说明免疫低下小鼠的分泌抗体的能力弱，同时也能说明造模成功；太岁组与模型组比较，抗体形成细胞数量显著升高，说明太岁能够促进免疫低下小鼠的B淋巴细胞产生抗体，从而参与机体的免疫调节。当然非特异性免疫是免疫反应的第一道防线，在免疫过程中也是极为重要的，当细菌、病毒等异物袭击机体时，机体就会开启第一道防线，激活巨噬细胞促进吞噬异物的能力，并传递外来抗原信息，由于细胞膜表面有多种受体〔69〕。实验结果显示，太岁有提高巨噬细胞吞噬作用的趋势，但是并无显著性，所以下一章将继续探讨太岁体外对巨噬细胞RAW264.7的影响。 3.6小结 太岁能够调节提高环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的脾脏指数、抗体形成细胞数量、促进T淋巴细胞增值、从而参与机体的体液免疫和细胞免疫功能，虽然对非特异性免疫调节效果并不是特别显著，但是也有一定的促进作用，所以太岁能够提高免疫低下小鼠的免疫力。 第四章太岁对巨噬细胞RAW264.7的影响 4.1引言 巨噬细胞是机体免疫系统的第二道防线，通过吞噬杀菌显示出非特异性免疫功能，通过抗原提呈启动细胞免疫，分泌细胞因子则参与了特异性免疫过程卩。】，所以巨噬细胞在系统免疫中粉演着重要角色。 本部分为体外实验，利用不同浓度太岁溶液作用于巨噬细胞RAW264.7,观察巨噬细胞的吞噬能力；以及观察太岁作用于LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7后，细胞分泌IL-1、IL-12和NO的情况，以此来评估太岁对免疫功能的影响。 4.2材料与方法 4.2.1实验细胞株 实验用细胞株：巨噬细胞RAW264.7,来自西南交通大学生命科学与工程学院。 4.2.2实验试剂
4.2.5.1细胞复苏' 传代与冻存 1. 巨噬细胞RAW264.7的复苏 于液氮中取出巨噬细胞RAW264.7冻存管，放入37°C恒温水浴中，解冻2 min。取出后，酒精对冻存管进行表面消毒后放入超净工作台内。移液器将管中的细胞液混匀然后缓慢转入细胞培养皿中，再次混匀后放入37C、5%CC）2孵育箱中进行培养。24 h后用DMEM高糖培养基进行常规培养。 2. 巨噬细胞RAW264.7的传代 取出细胞培养皿，于显微镜下观察巨噬细胞RAW264.7贴壁生长率。若生长率为70%-80%,则可以进行传代培养。移液器移去培养皿中培养液，缓慢加入常温PBS 清洗2-3次，吸出PBS后加入3mLDMEM培养基，用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞，用移液器反复吹打用使巨噬细胞RAW264.7悬浮于培养基中，然后将其转入无菌离心管中，1200r/min离心5 min；弃上清，加入2-3 mL培养基，移液器吹打混匀。取适量细胞液滴入血球计数板上，然后置于倒置相差显微镜下计数，稀释到合适的细胞浓度然后放入37C、5%CO2孵育箱中继续培养。 3. 巨噬细胞RAW264.7的冻存 当巨噬细胞RAW264.7的贴壁生长率接近80%时，弃去培养液，用PBS润洗2 次，操作同425.1 2。离心，吸弃上清液，按比例加入DMSO：胎牛血清=1:9,混匀重悬沉淀细胞，迅速转入冻存管中，并置于4°C 20 min,然后转入-20°C约40 min, 最后-80C冻存24h,最后转入液氮中长期保存。 4.2.5.2巨噬细胞RAW264.7活力检测 利用CCK-8法对巨噬细胞RAW264.7的活力进行检测。依照2.5X105个/mL的密度，100卩L/孔加入96孔板中，放入37 °C 5% CO2恒温培养箱中6h,等待细胞贴壁且生长率达到70%则可弃去培养液，依据分组，分别加入1%、10%太岁水溶液、LPS以及空白对照（培养基）处理24h：拍照后每孔加入10卩L的CCK-8,继续孵育2h,在450 nm波长下，检测吸光度（OD值）。巨噬细胞RAW264.7活力计算公式如下： 细胞活力=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）x100% 4.2.53巨噬细胞RAW264.7呑噬能力测定 将浓度为2.5X105个/mL的巨噬细胞悬液100卩L接种于96孔板各孔中培养，每组做3个平行孔。巨噬细胞经37 °C孵育12 h后，每孔加入0.05%无菌中性红生理盐水液100卩L, 37C 5% CO2恒温箱继续培养30 min。取出后，细胞经PBS洗涤3遍，每孔加入细胞溶解液（乙酸：无水乙醇=50 : 50） 100 |xL, 4°C放置4h。将表面洁净的24孔板置于用酶标仪中，于540 nm处测各孔吸光度。以OD值表示巨噬细 胞吞噬功能的强弱。 425.4 NO含量、IL-1含量、IL-12含量的检测 巨噬细胞RAW264.7按425.2铺板，孵育24 h后，各孔取上清100 pL分装于离心管中，2500 r/min离心20 min,取上清分别按一氧化氮测试盒、IL-1 ELISA试剂盒、 IL-12 ELISA试剂盒说明加样测定，剩余的上清可保存-20°C或-80C备用。 4.3结果与分析 4.3.1太岁对巨噬细胞RAW264.7活力的影响
用终浓度分别为1%太岁（”,终浓度1-2 mg/mL）、10%太岁（v/v,终浓度12mg/mL） 直接作用于巨噬细胞；与空白对照比较，10%太岁组增殖明显（PV0.05）, 1%太岁组也略有增加，说明太岁对巨噬细胞的增值有促进作用。LPS （终浓度5 jig/mL）刺激后，与空白对照比较，LPS组增殖也很显著（FV0.01）,说明LPS能激活巨噬细胞；与LPS 组比较，LPS+1%太岁、LPS+10%太岁组巨噬细胞的生长显著下降頒V0.01）。结果如图4-1所示。
4.3.2巨噬细胞RAW264.7呑噬能力测定
（注：VS 空白对照，**P<0.01, *P<0.05； vsLPS 组，^<0.01, #P<0.05） 如图4-2所示，不同浓度的太岁溶液直接作用于巨噬细胞后，与空白对照相比较, 巨噬细胞的吞噬能力都有所提高，其中10%太岁组有显著差异（尹V0.01）,说明太岁能够增加巨噬细胞的吞噬能力。终浓度5卩g/mL LPS刺激后，巨噬细胞吞噬能力与空白对照比较也显著提高（PV0.01）,说明LPS也可以激活巨噬细胞：LPS+1%太岁组与LPS组比较，吞噬能力却略微下降，LPS+10%太岁组吞噬能力有所提高，但无显著性差异；综上所述LPS刺激后能激活巨噬细胞，吞噬能力的强弱随着太岁浓度的增大而提高。如图4-3所示，细胞吞噬中性红后，胞内会被染上红色，吞噬能力越强的颜色越深。 LPSLPS+ 1 %溶太岁LPS+ 10% 太岁 图4-3太岁对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响 4.3.3 NO含量、IL-1含量和IL-12含量的测定 4.3.3.1太岁对巨噬细胞生成NO量的影响 按照NO测定试剂盒的说明，配置好不同浓度的标准品，依次加样，540 nm处测 定吸光度；最后以NaNOz浓度为横坐标，吸光度为纵坐标得到标准曲线，如图4-4 所示。
太岁溶液直接作用巨噬细胞后，与空白组比较太岁组巨噬细胞产生的NO量略有增加；加入刺激物LPS(终浓度5 pg/mL)后，与空白对照比较，LPS组的NO含量显著升高(P<0.01),加入太岁溶液后，巨噬细胞产生NO含量逐渐降低，其中LPS+1% 太岁组的NO含量显著降低(PV0.01), LPS+1O%太岁组生成NO含量也有所下降，但无显著性差异。如图4-5所示。
4.4讨论 吞噬能力在免疫调节中的地位众所周知。实验结果显示，太岁直接作用于巨噬细胞后，会激活巨噬细胞，使其的吞噬能力增强，来加强对细菌及其他异物的吞噬作用, 从而提高机体的免疫能力，其中随着太岁浓度的增大，吞噬能力也增强。当LPS刺激后，吞噬能力显著增加；但是在LPS和太岁的共同作用下，对巨噬细胞吞噬能力却出现了抑制的作用，可能是由于过度的刺激后细胞出现了损伤所导致的。而且太岁还可以刺激静息的巨噬细胞的增殖，尤其是10%浓度太岁增殖明显，LPS诱导后，太岁组又可以使细胞恢复至正常值水平，可能是跟细胞表面的受体或者是信号通路有关系I7,]o LPS是常用的巨噬细胞启动剂，可以经典的激活巨噬细胞，促使Ml的形成，Ml具有较高的抗原提呈能力QI。大量研究表明，活化后的巨噬细胞才能大量分泌IL-1, TNF-a、IL-12等细胞因子以及NO来增加表面分子诱导细胞免疫，杀灭病原微生物。文献显示㈣巨噬细胞被LPS或者IFN-Y诱导激活后，NO、IL-1分泌过多，从而会使机体的炎症反应增强，导致机体受到损伤。其中适量的NO作为激活巨噬细胞杀灭异物的主要效应分子，能提高机体免疫卩4〕。实验结果显示，太岁作用于巨噬细胞后，对于NO的形成略有促进作用，适量的NO可以促进免疫反应的发生；巨噬细胞被LPS激活后，产生了大量NO,当LPS和太岁共同作用下，NO的含量减少，太岁通过控制NO的产生从而发挥了免疫作用。在T淋巴细胞活化过程中，细胞因子IL-1 可以刺激T淋巴细胞的增殖【75】。在IL-1和ILU等细胞因子协同下，也可以促进B细胞增殖和分化，可以刺激促进免疫球蛋白的合成和分泌，从而发生细胞免疫反应。从而所以IL-1常常作为检测因子。实验结果显示，太岁可以直接激活静息状态的巨噬细胞，促进IL-1的产生，从而提高机体的免疫功能：当太岁作用于LPS诱导的巨噬细胞时，抑制了IL-1的产生，使其恢复至正常水平。IL-12在Thl分化过程中起着重要作用，Thl介导的细胞免疫清除胞内感染细菌卩縄有文献显示IL-12可以明显的促进NK和LAK的杀伤水平，并且调节淋巴细胞的增值，从而发生免疫应答。实验结果显示太岁直接作用于巨噬细胞后，刺激细胞分泌IL-12；当LPS诱导后，虽然也大量分泌IL-12,但是过量的分泌会损害细胞，所以再加入太岁后，IL-12的含量又逐渐减少使其恢复至正常水平。 4.5小结 1. 太岁能促进静息巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，增强对异物的吞噬作用。 2. 太岁能促进静息巨噬细胞RAW264.7分泌NO、IL-1、IL-12等的产生，激活免疫反应；对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7,太岁能够抑制细胞分泌NO、IL-1、IL-12, 避免反应过强。 结论 本论文以太岁为研究对象，研究其内生菌的种属分类及对常见菌的抑制作用；通过体内给太岁，研究其对免疫低下小鼠免疫功能的影响；以及在体外研究其对巨噬细胞RAW264.7的增值等，主要结论如下： 1. 太岁分离出了三种菌，通过对菌落的形态观察与生理生化分析，结合16SrRNA 分子生物学鉴定的方法，构建系统发育树，初步确定1号菌株为人2“次皿泊”師0勘3貼（假散囊菌属），2号菌则认定为Betaproteobacterium MBIC3293 （p变形菌属），3号菌初步认定为bacterium YC-ZS S-LK J183 （微小杆菌属）；且这三种菌株是第一次从太岁中分离得出。通过抑菌实验发现太岁及其分离菌发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌无明显抑制作用。 2. 太岁能够调节提高环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的脾脏指数、抗体形成细胞数量、促进T淋巴细胞增值、从而参与机体的体液免疫和细胞免疫功能，虽然对非特异性免疫调节效果并不是特别显著，但是也有一定的促进作用，所以太岁能够提高免疫低下小鼠的免疫力。 3. 体外实验中太岁激活能巨噬细胞RAW264.7,促进巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，增强对异物的吞噬作用；促进巨噬细胞RAW264.7分泌NO、IL-K IL-12；抑制LPS对巨噬细胞RAW264.7刺激作用。 致谢 本论文在导师喻凯教授的悉心指导下完成的，无论是从论文的选题、框架的设计以及最后论文的修改，喻凯老师都倾注了大量的心血并且花费了不少宝贵的时间，尤其是在框架设计方面，喻凯老师不辞辛苦的再三修改到最后的方案的敲定，并且实验中遇到的任何困难都细心的解答，才使得本实验能够顺利的完成；并且在审阅论文初稿时可谓是字斟句酌，耐心指出了我在很多细节上的错误。喻凯老师不仅知识渊博，工作上兢兢业业，治学态度严谨，对待同学们却是特别的热情，这也深深的激励着我, 在今后的生活中时时谨记并努力的提高自己。再次由衷的感激喻老师在生活以及学习 方面的帮助与关心。 由衷地感谢西南交通大学生命科学与工程学院能够提供这么一个优秀的平台，也感谢所有领导、老师和同学们；研究生这三年有过成功也有过失败，很开心能够遇到所有给与我帮助的所有老师，朋友，在我很开心的时候有人与我分享，在我失意时有你们帮助，也许只是一点小小帮助，但却是是我人生中最难忘的时刻，当然这也是我人生中最最最宝贵的回忆。同时感谢师兄张文明、李平，李鸿焯，陈炜、刘健，同门陈凯，师弟李佳睿等给予的大力支持与热心帮助，谢谢你们无私的帮助，才使得我论文能顺利完成。以及茹灿泉老师及实验室所有的师兄弟及同门，李学如老师及实验室的全体的人员，谢谢你们的帮助。 谢谢父母在我生活学习上无私的支持与理解，在我困惑的时候的开导，在我失意时的陪伴，谢谢你们的爱和付出，你们永远是我坚强的后盾，我永远深爱着你们。 最后，再次感谢所有在学习和生活中关心、支持和帮助我的老师、同学、朋友及家人，向他们表示最真挚的谢意! 参考文献 [1] 郑科研，董兆麟.不明物体“太岁"的初步研究[J].西北大学学报(自然科学版). 2010(06): 1012-1016. 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攻读硕士学位期间发表的论文 1. 王禹，李泓焯，喻凯,,李甫，王明奎.紫甘薯花青素对小鼠酒精性肝损伤的保护作 用的研究.华西药学杂志（已录用） 2. 李平，喻凯•，王禹，刘健，陈炜等.植物抗菌液对小鼠抗炎作用的研兖.华西药学 杂志
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