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神奇东方万物生 太岁福泽有缘人
 
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肉灵芝提取物抗肿瘤活性研究

来源:长春理工大学作者:王朋朋网址:http://www.csbly.com浏览数:77 
文章附图

硕士学位(毕业)论文

肉灵芝提取物抗肿瘤活性研究

研究生姓名:王朋朋

类别、领域:生物工程

。一八年四月

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长春理工大学硕士学位论文原创性声明

本人郑重声明:所呈交的硕士学位论文,《肉灵芝提取物抗肿瘤活性研充》是本人在指导教师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

作者签名:亀编制也]鲜直月止日

长春理工大学学位论文版权使用授权书

本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版权使 用规定”,同意长春理工大学保留并向中国科学信息研究所、中国优秀博硕士学位论文 全文数据库和CNKI系列数据库及其它国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,也可釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。

作者签名:土朗作词年E月芟日

导师签名:題蹈物86LD

肉灵芝民间称为太岁,李时珍《本草纲目》记载有肉灵芝,并把它收入“菜”部“芝” 类,可食用、入药,奉为“本经上品",功效为“久食,轻身不老,延年神仙"。现代研究 表明太岁是一种黏菌,是介于生物和真菌之间的一种原质体生物,既有原生物特点, 也有真菌特点,是一种“特大型罕见粘菌复合体”。肉灵芝具有抗氧化、消炎、提高机 体免疫力等多重药理作用,但其在抗肿瘤研究方面报道较少。

本文以白山市林源春生物科技有限公司与本实验室合作人工培育的肉灵芝提取物为研究对象,分别测定了肉灵芝提取物中多糖、毗咯哇咻醍(PQQ)的含量;肉灵芝体外抗肿瘤活性研究中釆用MTTHocheset染色法.Annexin V-FITC/PI双荧光染色、PI单染流式细胞术检测肉灵芝提取物对HepG2细胞增殖、凋亡形态学、早期凋率、周期的影响;同时,通过肉灵芝提取物对ICR荷瘤小鼠体重、皮下瘤重、免疫器官、巨噬细胞吞噬功能、T细胞和B细胞刺激指数、NK细胞活性、ICR小鼠脾脏免疫细胞亚群、血清IL-2IgGIgM的影响来探讨肉灵芝提取物体内抗肿瘤活性。

对肉灵芝提取物成分分析结果表明,其中多糖含量为165.800±15.011 mg/g, PQQ 含量为4.198±0.641 mg/g,与文献报道的野生肉灵芝的含量相当。体外细胞存活率实验结果表明肉灵芝提取物对HepG2LO2细胞都有抑制作用,其中对HepG2细胞的抑制作用更强。对HepG2细胞经Hoechst染色结果说明肉灵芝提取物能够诱导细胞凋0Annexin V F1TC/PI双荧光染色结果说明肉灵芝提取物可引起HepG2细胞早期凋亡。PI单染结果表明肉灵芝提取物诱导细胞凋亡引起DNA量减少;体内ICR小鼠荷瘤实验结果表明:肉灵芝提取物有减缓荷瘤鼠体重下降的趋势,可明显抑制荷瘤鼠肿瘤的生长,有明显保护胸腺的作用,有改善巨噬细胞吞噬的趋势,可显著提高T细胞刺激指数、NK细胞活性、CD3+T淋巴细胞亚群百分比、IL-2的含量,因此肉灵芝提取物对荷瘤鼠机体免疫力具有明显的增强作用。上述实验结果为人工培育肉灵芝应用于抗肿瘤的药物研发提供了实验依据。

关键词:肉灵芝提取物HepG2细胞细胞凋亡抗肿瘤免疫调节


Abstract

Meat-like Ganoderma lucidum(MGL) is called taisui in Chinese folk and is also recorded in Li Shizhen's HCompendium of Materia Medica**. It's believed that MGL can be used as food and medicine. Because of the function of prolonging life, MGL is regarded as *'the superior product1* in Compendium of Materia Medica”. Modem studies shows that tai sui is a Myxomycete complex, a protoplast organism between a creature and a fungus, which possesses original and fungal characteristics. It has multiple pharmacological functions, such as antioxidation, anti-inflammation, improving immunity and so on, but there are few reports on anti-tumor research.

To study the function of MGL on anti-tumor, the composition, like polysaccharide and pyrroloquinoline quinone(PQQ), of MGL extract were measured. To study on the antitumor activity of MGL in vitro, MTT method, Hocheset staining method, Annexin V F1TC/PI double fluorescence staining, PI single dye flow cytometry were used to detect the effect of MGL extract on HepG2 in cell proliferation, apoptosis morphology, early apoptosis rate and cell cycle. In the meantime, the change of some phenotypic traits, weight and immune organ weight, macrophage phagocytosis and T cell and B cell stimulation index, NK cell activity, ICR tumor-bearing mice spleen immune cell subsets and serum IL - 2, IgG and IgM were tested.

Analyzing the content of the extract of MGL extract shows that polysaccharide was 165.800± 15.011 mg/g, PQQ was 4.198±0.641 mg/g. The content of Ganoderma lucidum is similar to that reported in the literature, cell viability results show that MGL extract has inhibitory effect on HepG2 and LO2 cells, and HepG2 cells survival rate is low compared with LO2 cell In vitro. So, we can conclude that MGL extract can selectively inhibit cell growth. Hoechst staining shows that MGL extract could induce apoptosis. Annexin V FITC/PI double fluorescence staining shows that MGL extract could cause early apoptosis of HepG2 cells. The results of PI single dyeing show that MGL extract could induce cell apoptosis and decrease the amount of DNA. vivo experiments show that MGL extract can slow the tumor-burdened rat weight loss, obviously inhibit the growth of a tumor-burdened mouse tumor, significantly protect the thymus, improve the T cells stimulate index, NK cell


activity, CD3 + T lymphocyte subgroup percentage, the content of IL - 2. This study provides an experimental basis for the research and development of antitumor drugs of MGL. The above experimental results provide an experimental basis for the artificial cultivation of MGL for anti-tumor drug development.

Key word: Extract of MGL HepG2 Cell Apoptosis Anti-tumor Immunoregulation

hi

目录

摘要I

AbstractII

目录I

英文缩写词I

第一章绪论1

1.1肿瘤发展现状及治疗状况1

1.2肉灵芝简介2

1.2.1肉灵芝组成2

1.2.2肉灵芝化学成分4

1.3 机体免疫与肿瘤发生5

1.3.1免疫器官5

1.3.2免疫细胞6

1.3.3 免疫分子7

1.4本文研究的目的及内容7

第二章肉灵芝提取物体外抗肿瘤活性研究8

2.1实验材料8

2.1.1实验仪器与药品8

2.1.2主要试剂的配制9

2.2实验方法10

2.2.1苯酚-硫酸法测定肉灵芝提取物中多糖含量10

2.2.2 NBT-Gly法测定肉灵芝提取物中毗咯哇嚇醍(PQQ)含量11

2.2.3细胞复苏、培养与冻存13

2.2.4肉灵芝提取物对HepG2LO2细胞存活率的影响14

2.2.5肉灵芝提取物诱导HepG2细胞凋亡检测14

2.2.6流式细胞术凋亡检测14

2.2.7肉灵芝提取物诱导HepG2细胞凋亡的细胞周期检测15

2.2.8结果统计与分析16


2.3实验结果与讨论16

2.3.1苯酚-硫酸法测定肉灵芝提取物中多糖含量16

2.3.2 NBT-Gly法测定肉灵芝提取物中毗咯喳咻醍(PQQ)含量17

2.3.3肉灵芝提取物对HepG2L02细胞存活率的影响18

2.3.4肉灵芝提取物诱导HepG2细胞凋亡检测19

2.3.5流式细胞术凋亡检测21

2.3.6肉灵芝提取物诱导HepG2细胞凋亡的细胞周期检测22

2.4小结24

第三章肉灵芝提取物体内抗肿瘤活性研究25

3.1实验材料25

3.1.1实验样品与实验动物25

3.1.2实验仪器及药品25

3.2实验方法26

3.2.1分组和给药26

3.2.2肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠体重的影响27

3.2.3肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠皮下移植瘤的影响27

3.2.4肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响28

3.2.5肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏TB淋巴细胞功能影响28

3.2.6肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响28

3.2.7肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏NK细胞功能的影响28

3.2.8肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏免疫T细胞亚群的影响29

3.2.9肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠血清中IL-2IgGIgM含量的影响...29

3.2.10结果统计与分析29

3.3实验结果与讨论29

3.3.1肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠体重的影响29

3.3.2肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠皮下移植瘤的影响31

3.3.3肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响32

3.3.4肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏TB淋巴细胞功能的影响33

3.3.5肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响34

3.3.6肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏NK细胞功能的影响35

3.3.7肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏免疫T细胞亚群的影响36

3.3.8肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠血清中IL-2IgGIgM含量的影响...38

3.4小结39

结论42

致谢44

参考文献45

硕士学位期间取得的研究成果49

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第一章绪论

1.1肿瘤发展现状及治疗状况

随着科学技术及其社会经济水平的不断发展,人类的生活习惯和生存环境都发生了极大的改变,长期处在不良的外部环境及不规律的饮食习惯等多种不利因素影响下,大大增加了人类患恶性肿瘤的几率。经世界卫生组织统计数据中可以看出,截止到2012年的各类疾病的发病率和死亡率,肿瘤的发病率和死亡率增长是最高、最快的。且数据分析表明,发达国家和发展中国家肿瘤的发病率与死亡率呈现不同的发展趋势,即发达国家肿瘤的发病率和死亡率是呈现一个下降的趋势;而发展中国家肿瘤发病率与死亡率仍然呈现一个上升的趋势,并且这个上升速度比较快。这其中,亚洲新增肿瘤患者约占全球总量的45 %o在中国,2013 年与2012相比,癌症患者数量继续增长,从35800003680000,同比增长3%⑴。

《世界癌症报告2014》研究表明世界肿瘤病例仍将急速增长。该研究统计及预测2012年、2025年和2035年的癌症患者分别是1400万、约1900万、约2400万,从数据上可以看出随着时间的延长,肿瘤患者数量不断攀升。其中,女性癌症发病率最高的是乳腺癌,男性癌症发病率最高的是肺癌。癌症的有效预防和治疗刻不容缓。不言而喻,癌症己成为全球乃至我国公关卫生和医疗领域共同面对的难题。

当前,癌症治疗手段主要有以下几种:外科手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、靶向疗法、生物治疗和中医中药治疗〔2用。每种方法都各有千秋,但也都存在着不足之处。外科手术治疗是通过将病灶的肿瘤部位通过手术方法切除,该方法复发性较强,并且术后创面较大,患者恢复较慢。放射治疗简称放疗,该方法是通过高能电磁辐射线作用肿瘤细胞,该方法的治疗周期较长,并且需要高昂手术费用。化学药物治疗简称化疗,化疗会对患者有一定治疗效果,但是其本身的毒副作用较大,对正常的组织及细胞会有一定的伤害"I,并且会使人体免疫系统受损,导致免疫系统不能正常发挥监视、保护机体和杀伤肿瘤细胞的作用。靶向疗法是指通过特定的靶向药物对病灶部位进行作用。但是靶向疗法对药物的靶向性具有较高的要求,并且其杀伤率高且价格昂贵。生物治疗是近年来新兴的一种生物治疗方法,但是目前尚处于研发和临床试验阶段,技术尚不成熟。中医中药治疗方法是目前为止较为安全、有效、毒副作用低的癌症治疗手段。该疗法主要是指通过提高人体免疫力进而增强机体对肿瘤细胞的杀伤能力,实现对肿瘤的有效治疗。中医中药中涉及的天然药物具有价格低廉、毒副作用低、标本兼治等优点,所以采用天然药物进行抗肿瘤研究己成为当前癌症治疗的一大热点。

1.2肉灵芝简介

肉灵芝(Meat-like Ganoderma lucidum, MGL)民间又称太岁,目前对肉灵芝的实验研究还未确定它的生物学分类,是神秘的“未知生物”,不属于其他三种 常见生物类群(动物,植物,微生物),被称为第四生命体。它们被发现的位置 一般是在地下或河边,说明这种“未知生物”生活环境应该在土壤中或水中。研究人员对“未知生物”的生物组成进行分离鉴定后发现,“未知生物”中含有大 量的黏菌和少量的霉菌、细菌和酵母菌,又因为“不明生物”主要由微生物组 成,故专称为“特大型罕见黏菌复合物”回。目前对肉灵芝研究过少,主要信息 来源于民间传说和个别新闻报道。在明代医学家李时珍的《本草纲目》中提到," 肉芝状如肉,乃生物也,白者如截肪,黄者如紫金,皆光明洞彻如坚冰也”。《神 农本草经》也有记载到"肉灵芝,无毒,补中、益精气、久服轻身不老"。两者 都是描述肉灵芝的药用价值。

1.2.1肉灵芝组成

西北大学13位生物专家在生理、细胞、微生物、真菌等方面,对1992年在陕西省周至县汾河滩发现的肉灵芝样品进行了分析研究,研究结果发现,肉灵芝既有真菌的特点,也有原生质生物的特点;肉灵芝中还有细菌、酵母菌、霉菌等微生物,以及几丁质、核酸、蛋白质等营养物质,综上分析将其定名为“特大型黏菌复合体”⑹。

河北省科学院微生物研究所对1994年在河北省完县李思庄矿井中喷出的 “怪肉”进行研究,得出了与河北省科学院微生物研究所相似的结论。南开大学生命科学学院白玉华教授对陕西省周至县发现的“怪肉,,进行切片研究,在显微 镜下观察“怪”切片,发现了 “怪”体内有菌丝,初步确定为高级真菌。

2002年在吉林桦甸夹皮沟云峰村双合屯发现了一个特大“不明生物体”,切 开后呈现多层次结构,有弹性。吉林大学生命科学院经过研究,发现它是介于原 生物与真菌之间的粘细菌,生活于土壤中,生命力极强,是自然界非常稀有的大 型粘细菌复合体。

针对肉灵芝属于“罕见粘菌复合体”这一说法,中国科学院微生物所形态学专家卯晓岚持有不同看法,他称曾多次见过这种神秘的“怪肉”。他通过对其生命成分的化学分析证实,这种生物含有大量的水。但即不含有蛋白质也不含有核酸,说它有生命很勉强。对于在火上烧,能闻到呛鼻的味道,故估测其含有醛基、醇基或羟基成分。由于粘菌必须具备蛋白质和核酸成分,因此卯晓岚判断“怪肉” 不是粘菌复合体。

上述观点的不同,原因应该是肉灵芝有不同的起源、且限于菌株的分离和纯培养技术的局限性,以及对某些组成微生物的尚不清楚造成的。

王欣⑶对渭河“大型粘菌复合体”研究,采用菌种分离和分子生物学方法, 从样品中分离微生物,得到1株黏菌和35株细菌,其中优势细菌种群是B-变形菌纲伯克氏菌目Burkholderiales),扩充了对肉灵芝样品中菌种的认知。西北大学戴璐凶研究“大型粘菌复合体”,釆用有饲培养技术从肉灵芝中分离出疣泡钙 皮菌Didymium verrucosporum)和扁垫双皮菌(Diderma deplanatum)2 种黏菌,又釆用传统的平板培养方法、克隆文库序列分析和末端限制性片段长度多态性(Terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)3 种方法初步得到了枝顶抱霉属(Acremonium)^木霉(Trichoderma)赤霉属(Gibberelld)等至少18 个类群的真菌。

林涧等人【9】对北京大兴刘志军赠送的这两种肉灵芝样品进行菌种分离和分子鉴定,均分离到了黏质红酵母Rhodotorula mucilaginosa),从而推测黏质红酵母可能是肉灵芝中的一个优势菌群,同时也检测到另一些不同的细菌、霉菌和酵母菌【9】。郑科研等人〔6】对西北大学提供和河北牛先生提供的两种肉灵芝进行组成分析,分离得到20多株黏菌、大量的细菌和霉菌以及少量的酵母菌,发现这两种肉灵芝样品中聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol, PVA)占大部分,此外还有含有约14.48%的多糖,同时确定有木糖和半乳糖。而且在培养肉灵芝的过程中发现,如果黏菌与霉菌共生培养,在培养过程中所有的霉菌都会逐渐消失,后期会全长成黏菌,说明黏菌应该是肉灵芝中微生物重要的组成部分。

王朝江卩°】采用16S r DNA克隆文库的方法,对北京电视台转赠的肉灵芝样品进行了系统研究,并分析了肉灵芝中的菌属和菌群,结果显示,分离出的细菌归属于4个门9个目,在总菌目中优势菌目芽/杆菌目(Bacillales)约占33.01%柄杆菌目(Caulobacterales)约占32.04%和伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)约占12.62%o在总菌属中优势菌属短波单胞菌属(Brevz/〃力/mows)约占30.10%、葡萄球菌属(S/ap/?*/ococc"s)约占29.13%和食酸菌属(Acidovorax)约占7.77%。这也直接说明上述肉灵芝样品中细菌种类多样。同时王朝江还采用高通量测序技术检测肉灵芝的古菌域【⑴,他挑选了三个具有典型地域特征的肉灵芝样品,检测这三个 样品的古菌属和所占比例。结果显示这三个样品均有共同的优势属一甲烷杆菌属 (Methanobacterium Kluyver and Van Niel),占前三的优势古菌分别是甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷球菌属。

韩晓伟等人[⑵釆用16S rRNA高通量测序方法,对黄河太岁中的微生物进行 了分析,发现其含有多种细菌。其中优势菌群有乳酸菌(Lactobacillus)盐单胞菌菌(Halomonas)粪球菌属(Coprococcus)^ 10个菌属,表现出与单一物种不同的特性。

1.2.2肉灵芝化学成分

研究结果显示,肉灵芝中含有水的百分比很高,此外还富含无机盐、核酸、脂类、多糖类、维生素、氨基酸及蛋白质等营养成分,是一种宝贵的自然资源,被誉为"生物和氏璧”卩3)。

朱玉春等人⑷对实验室保存的7种肉灵芝样品进行了化学成分的测定。釆用超声波提取法(S61(uitrasonic Extraction,UE)来提取7种肉灵芝样品中的粗多糖,釆用苯酚-硫酸法"I测定这7种肉灵芝样品中粗多糖含量。结果表明,此7 种肉灵芝样品中粗多糖含量范围在8.9746.57mg/g之间不等;釆用索氏(Soxhlet) 提取法卩89]检测此7种肉灵芝样品中粗脂肪含量,结果表明,此7种肉灵芝样品中粗脂肪含量范围在2.24.8mg/g之间;采用凯氏定氮法【2。列测定此7种肉灵芝中粗蛋白含量,结果表明,此7种肉灵芝样品中粗蛋白含量范围在20.35184.18mg/g之间;采用分光光度法(Spectrophotometry, SP)122'231测定此7种肉灵芝样品的核酸含量,结果表明,此7种肉灵芝样品中净核酸含量范围在22.053 35.128g/g之间;釆用重量法(Gravimetric Method, GM)24'25]测定此7种肉灵芝样品的粗灰分含量,结果显示,此7种肉灵芝样品中粗灰分含量范围在42.93 246.4mg/g之间;采用干燥法〔26】测定此7种肉灵芝样品中的水分含量,结果表明,此7种肉灵芝样品种的水含量都比较高,含水率都在90%以上;釆用原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy, A AS)"测定此7种肉灵芝样品中各种微量元素的含量,结果表明,此7种肉灵芝样品中微量元素含量从高到低为铁、钙、锌、车孟、铜、铅和镉几乎没有。此外日本科学家还测定了肉灵芝和26种常见食物的毗咯哇嚇醍(Pyrroloquinoline quinone, PQQ)含量,发现肉灵芝中的PQQ含量远远高于26种常见食物中的PQQ含量,说明肉灵芝中含有丰富的PQQo

1.2.3肉灵芝的功效

肉灵芝中丰富的营养成分〔28]和多样的生物组成决定了它具有多种药理作用,具体体现在:

(1) 抗菌作用

辽宁大学白婷婷291分离一个肉灵芝样品,提取其中的多糖得到提取液,对多糖提取液进行抑菌实验,结果发现“太LNUT003多糖提取液对十种微生物有抑菌效果,如玉米小斑病菌maydis)蜡状芽抱杆菌(Bac/"s cereus)番茄早疫病菌Alternaria so/am)等菌。西北大学王欣卩】从黏菌复合体中分离出三种抑菌菌株。并对这三种菌的发酵上清液和粗多糖溶液分别进行了抑菌实验,结果发现三种菌发酵上清液和粗多糖溶液对于马铃薯干腐病菌和番茄早疫病菌的抑制作用最强。而且除去抑菌物质,单独的粗多糖溶液也有比较强的抑菌效果。

(2) 提高机体免疫力

西南交通大学王禹㈣通过构建昆明小鼠(Kunming mice, KM小鼠)免疫低下 的模型,采用肉灵芝对受试KM小鼠灌胃给药来分析肉灵芝的药理作用。实验结果显示,肉灵芝对免疫低下的KM小鼠有保护免疫器官脾脏,促进吞噬细胞吞噬的功能,并能促进B淋巴细胞分泌抗体,T淋巴细胞增殖。从上述实验结果可看出肉灵芝具有增强免疫低下KM小鼠的天然免疫以及特异性免疫中的体液免疫和细胞免疫的作用。

(3) 抗肿瘤

白婷婷29]还利用肉灵芝多糖提取液进行了体外抗肿瘤活性试验。经过筛选癌细胞,多糖提取液对3种癌细胞有抑制作用,分别是对肝癌细胞株(HepG2) 的抑制率为77.17%、对胃癌细胞株(BGC-823)的抑制率为77.99%、对肺癌细胞株(A549)的抑制率为60.87%。山东中医药大学基础医学院王育纯等人⑶】使 用肉灵芝浸出液和水煎液对S180肉瘤小鼠的体内抗肿瘤活性进行了研究,结果发现肉灵芝浸出液组、肉灵芝水煎液组都对S180肉瘤有一定的抑制作用。朱清华等人研究发现神秘肉团肉灵芝有抑制小鼠肿瘤生长的效果,包括使荷瘤鼠肿瘤生长速度减慢或者使移植动物体内的肿瘤细胞不能生长的作用。此外,有研究还表明肉灵芝也具有抗衰老、抗氧化、祛斑美容的功效。

1.3机体免疫与肿瘤发生

免疫是机体的一种防御功能,利用机体免疫系统识别“自己”和“非”, 并通过免疫应答排除或消灭“非己”物质,维持生物机体的健康平衡状态,与疾病的发生有着密切的关系〔32】,而且对于预防及治疗传染性疾病以及抗肿瘤方面具有良好的效果。机体免疫分为非特异性免疫和特异性免疫两大类。免疫完成的物质基础是机体的免疫系统,主要包括免疫器官、免疫细胞以及免疫分子。

1.3.1免疫器官

机体免疫器官主要包括胸腺、脾、骨髓、淋巴结等【33-35】。

(1) 胸腺

胸腺是机体的重要免疫器官,是T淋巴细胞分化、发育和成熟的场所。胸腺生长过程中,免疫细胞由骨髓造血干细胞转移到胸腺中,在皮质增殖分化,分化的细胞转移到外周免疫器官并参与细胞免疫【36】。免疫系统需要胸腺中的T巴细胞,若缺少成熟的T淋巴细胞,则会致使机体免疫混乱,进而引起各类免疫疾病"I

(2) 脾脏

脾脏也是机体重要的免疫器官之一,含有大量淋巴细胞和巨噬细胞,是免疫系统防御外围入侵的主要部位,是发生免疫应答的主要场所,也是免疫调节的中心。当外源抗原刺激淋巴细胞后,淋巴细胞便会增殖分化,并分泌相应的抗体及细胞因子参与免疫应答【38】。

1.3.2免疫细胞

参与机体免疫应答和免疫反应的免疫细胞主要有淋巴细胞、单核/巨噬细胞、 自然杀伤细胞等。其中淋巴细胞是机体免疫重要的效应细胞139'40)o

(1)巨噬细胞

巨噬细胞(Macrophages, mo)主要通过胚胎或骨髓中的单核细胞分化而来1"42]。在机体免疫中具有吞噬等重要功能,是非特异性免疫系统中十分重要的免疫细胞【43,的。巨噬细胞在先天性免疫及获得性免疫系统中充当重要角色

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(2) T淋巴细胞

T淋巴细胞来源于骨髓干细胞,主要是在胸腺内成熟并分化的。在胸腺激素和其他免疫因子的诱导下,可分化成不同功能的成熟T淋巴细胞。成熟的T巴细胞具有主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)限制性识别功能,并且经血液循环后,在淋巴外周血等免疫器官周围发挥免疫调节作用网。T淋巴细胞按照功能和作用主要可分为T辅助细胞(T helper cells, Th)细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cell, TcCTL)两大类⑶网。初始CD4+T细胞可以进一步分化为功能不同的CD" T辅助子亚群53-59],在抗肿瘤免疫,器官移植,超敏反应,免疫耐受,自身免疫病等方面具有重要地位6。应]。

(3) B淋巴细胞

B淋巴细胞主要由骨髓造血干细胞分化而来,在骨髓中生长、分化、成熟。成熟的B细胞会透过毛细血管进入血液循环聚集在脾脏、淋巴结等外周免疫器官,受外来抗原刺激活化后产生抗体发挥免疫应答【63】。B淋巴细胞能够通过产生


抗肿瘤抗体,分泌多种细胞因子、作为抗原提呈细胞等多种方式正向调控抗肿瘤免疫进程,进而维护机体免疫平衡。

(4) NK细胞

自然杀伤细胞(Natural Killer cell, NK)是机体非特异性免疫的重要细胞之一, 参与机体免疫调节,具有直接杀伤多种肿瘤细胞,抗病毒感染,分泌干扰素等能 力,在抗肿瘤方面拥有良好的发展前景。

1.3.3免疫分子

机体免疫分子主要包括膜表面免疫分子和体液免疫分子两大类。在抗肿瘤研究方面,体液免疫分子中的抗体、细胞因子是当前研究的热点,如免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG),白细胞介素-2 (Interleukin-2, IL-2)等四冋。上述免疫分子主要通过直接作用靶点或反作用于免疫细胞和免疫器官发挥作用。

1.4本文研究的目的及内容

迄今为止,对于肉灵芝的研究非常少,大部分都是对肉灵芝中的微生物分析。尚未确定肉灵芝在已有生物界的位置,肉灵芝抗肿瘤及提高机体免疫力方面研究较少。基于当前恶性肿瘤的发病率越来越高,常规手术、放疗、化疗副作用比较大,且术后机体免疫系统损伤严重,使病人的术后生存质量和生存状态堪忧的事实,从自然界寻求具有抗肿瘤能力强、提高机体免疫力效果好、以代替副作用较大的化药的天然药物成为人们关注的焦点,本文选取肉灵芝提取物,以HepG2 细胞为实验对象进行体外抗肿瘤活性研究,以注射肝癌细胞(H22)ICR荷瘤小鼠为实验对象进行肉灵芝提取物体内的抗肿瘤活性研究。

具体研究内容如下:

(1) 体外抗肿瘤活性研究:首先采用苯酚-硫酸法、NBT-Gly法分别检测肉灵芝提取物中多糖含量、毗咯哇嚇醍(PQQ)含量:然后采用肉灵芝提取物对人肝癌细胞(HepG2)和人正常肝细胞(L02)进行MTT实验验证是否有细胞毒性;Hoechst33258染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术、PI单染检测细胞周期这三种方法检测肉灵芝提取物对HepG2细胞抗肿瘤活性研究。验证肉灵芝提取物是否对HepG2细胞有抗肿瘤细胞活性。

(2) 体内抗肿瘤活性研究:釆用向ICR小鼠注射H22细胞进行肿瘤模型造模,使用ICR荷瘤鼠模型通过对1CR荷瘤鼠体重、皮下瘤重、免疫器官、巨噬细胞吞噬功能、T细胞和B细胞刺激指数、NK细胞活性、对ICR小鼠脾脏免疫细胞亚群的影响、血清IL-2, IgGIgM的含量检测来评价肉灵芝提取物是否具有体内抗肿瘤活性。

第二章肉灵芝提取物体外抗肿瘤活性研究

多糖是一些天然药物中抗肿瘤活性最常见的物质,它具有抗肿瘤、降血糖、抗衰老等作用。毗咯喳咻醒(PQQ)是一种新型辅酶,它比较稀少,微量高效,它具有抗癌66]、提高免疫力、防治老年痴呆症等作用。

本章节先通过苯酚-硫酸法、NBT-Gly法【671分别测定肉灵芝提取物中的多糖和PQQ的含量,再通过肉灵芝提取物对HepG2细胞和L02细胞进行MTT验验证是否有细胞毒性;Hoechst 33258染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术、PI单染检测细胞周期这三种方法对肉灵芝提取物对HepG2细胞体外抗肿瘤活性研究。

2.1实验材料

2.1.1实验仪器与药品

3.png4.png


2.1.2主要试剂的配制

1)1.5 mg/mL肉灵芝提取液:使用蒸馆水作为溶剂,1.5 g肉灵芝提取物干粉溶于900 mL蒸馅水中,混匀,转移到规格为1000 mL的容量瓶中,定容1000 mL,混匀,4°C保存。测定肉灵芝提取物中多糖和PQQ含量专用。

2)15 mg/mL肉灵芝提取液:使用DMEM高糖培养基作为溶剂,1.5 g灵芝提取物干粉溶于100 mL DMEM高糖培养基中,使用pH计调节到pH 7.0, 溶液用0.22m滤器过滤,-20C保存。体外抗肿瘤实验专用。

(1) PBS (磷酸盐缓冲液)配制:用电子天平称取Na2HPO4 0.72gKC1 0.10 gNaCl 3.95 g, KH2PO4 0.12 g,用蒸馅水450 mL 溶解,调节pH 7.0,转移到500 mL容量瓶中,定容至500 mL,灭菌,4°C保存。

(2) MTT工作液:用50 mL PBS溶解0.25 g四甲基偶氮哩盐(MTT),滤、分装、-20°C避光保存。

(3) 细胞培养液配方(100 mL)成分含量:87.0 % DMEM/HG基础培养基、10.0%胎牛血清、1.0%青霉素链霉素、1.0%丙酮酸钠、1.0%MEMNEAA, 混匀使用0.22m无菌滤器过滤,分装50 mL离心筒,于4C冰箱中保存。

(4) 胰蛋白酶(含EDTA)1.25g胰酶和0.1 g EDTA溶于400 mL PBS, 使用pH计搅拌混匀,用碳酸氢钠溶液调节pH7.2,加入100 mL PBS混匀,使用0.22m滤器过滤,分装,放入-20C冰箱保存。

(5) Hoechst 33258 溶液配制:100 mL 蒸馋水溶解5 mg Hoechst 33258 粉末,混匀直至所有固体溶解完,无菌条件下0.22 pm过滤,离心(Eppendorf, EP) 管分装,-20°C避光保存。用时融化,用蒸馄水稀释10倍成染色液。

(6) 4%多聚甲醛细胞固定液:电子天平称取4 g多聚甲醛(粉末状)、2.9 g磷酸氢二钠、0.2965 g磷酸二氢钠和100 mL蒸馅水,然后一起转移到锥形瓶中,使用磁力搅拌器在70°C条件下振荡18小时。

(7) 2%的次氯酸钠溶液:把10 %的次氯酸钠溶液用蒸馄水稀释5倍到次氯酸钠浓度为2%,用于冲洗流式细胞仪。

2.2实验方法

2.2.1苯酚-硫酸法测定肉灵芝提取物中多糖含量

98 %的浓硫酸是强氧化剂,遇到水会放出大量的热量,可催化多糖水解成单糖,水蒸发后,继续氧化单糖脱水生成糖醛物质,在浓硫酸的催化下可与有弱还原性的苯酚生成橙黄色化合物,这种化合物在490 nm处有特征吸收峰,且吸光值与多糖浓度呈良好的线性关系。从而实现对样品中多糖的含量测定。

2.2.1.1主要溶液

(1) 浓硫酸:分析纯,98% o

(2) 80 %苯酚的配制:称量20g苯酚(分析纯),蒸馅水定容50 mL量瓶,避光-20°C保存。

(3) 6%苯酚的配制:用蒸馄水对80 %苯酚稀释而成(现用现配)。

(4) 葡萄糖标准品(分析纯)。

2.2.1.2葡萄糖标准曲线制作

(1) 用电子天平精确称取标准葡萄糖50 mg用蒸馋水溶解,后至于容量瓶中,用蒸馅水定容250 mL,得到葡萄糖标准液(0.2 mg/mL)0

2)首先,分别将标准葡萄糖溶液和蒸馅水按表2-3所示加入1-6试管中, 溶解,得葡萄糖浓度依次为 0 mg/mL0.02 mg/mL0.04mg/mL0.08mg/mL0.12 mg/mL> 0.16 mg/mL 溶液。

3)然后,按表2-3,在每管中加入1 mL6%的苯酚,混匀后,再缓慢加5mL98%浓硫酸(小心以防被烫伤),然后晃动试管架,使试管冷却。

4)25°C条件下放置25 min,于分光光度计490 nm处测多糖的OD, 用蒸馅水作空白对照,测得数据釆用Microsoft Excel做标准曲线。

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2.2.1.3样品溶液制备及含量测定

肉灵芝提取液1.5 mg/mL) 50 mL用蒸馅水稀释在100 mL容量瓶中,使肉灵芝提取液1.5 mg/mL)样品被稀释2倍。后取稀释好的样品2 mL,按步骤221.2 中(3)4)进行操作。经换算,得出肉灵芝提取物中多糖含量(至少三组平行试验)。

2.2.2 NBT-Gly法测定肉灵芝提取物中毗咯喳嚇醍PQQ)含量

PQQ的结构式(图1)中有两个相邻的醛基(氧化型)时,可缩写成PQQ(O2
此物在碱性条件下,可氧化甘氨酸,而本身被还原即醛基被还原为经基(还原型),
可缩写为PQQ(OH)2 ,与此同时产生的过氧化物的阴离子,可使NBT
Nitrotetrazolium Blue chloride, NBT)还原生成甲磨化合物(反应如下):

NH:—CH—COO- \ f PQQ(OH)2\ f 2O+2H*\ f NBT(还原型)
NH=CH—COO I \ PQQ(O)2 J \ 20,/ \ NBT(氧化型)

该化合物在530nm有最大消光值A(以下A均指530nm处的消光值).在规定 条件下,其消光值A大小与PQQ含量高低成正比关系,因此,检测甲腊化合物530nm的消光值即可推算出PQQ的含量.醒式氧化还原循环的效率依赖于醒的 性质,在游离醒中,PQQ催化此反应最有效。

2.2.2.1主要溶液配制

1)0.02 moL/L磷酸盐缓冲液PBS)配制:电子天平称量1.2366 g硼酸固体,蒸馅水定容1 L晃动混匀。取1 mL硼酸溶液,0.7728 g NaH2PO4«H2O , 8.5gNaCl, 5.1552 gNa2HPO4*12H2O用加蒸馅水950 mL,用浓盐酸或浓氢氧化钠调节pH7.0,补足蒸馄水定容1 L,晃动混匀,配成0.02 moL/L磷酸盐缓冲液。

(1) PQQ标准液(1g/mL)配制:电子天平称取PQQ固体标准品0.1 g,蒸馅水定容1 L,用锡箔纸包住避光,反复上下颠倒,取1 mL PQQ稀释液加蒸馋水定容100 mL,反复颠倒,PQQ终浓度为1g/mL

(2) PQQ各梯度稀释液:取PQQ标准液(1g/mL) 20L加入80L PBS 混匀,取50L溶液加入50L PBS混匀,取50L溶液加入50L PBS混匀, 循环几次就可得到浓度为 0.8 |ig/mL0.6 |ig/mL0.25)ig/mL0.125 g/mL0.0625 g/mLPQQ各梯度稀释液。

(3) Gly-KOH配制:电子天平称量甘氨酸(Glycine, Gly) 15.14 g,溶于80 mL蒸馅水中,用1 moL/L KOH调节pH10,转移到100 mL容量瓶中补足蒸馋水定容至100 mLo

(4) NBT (浓度3.6 mmol/L)配制:电子天平称取0.736 g NBT用蒸馅水溶解定容于250 mL容量瓶,混匀。

2.2.2.2 PQQ标准曲线的制作

(1) 6个干净的1.5mLEP管,如表2-4标记好每个EP管,每个管中加80L PQQ标准稀释液(表2-4PQQ标准液和蒸馅水的混合液).320L PBS, 720LGly-KOH80LNBT,ImL移液枪混匀。

(2) 分别取1-6管中上述混合液300L加于96孔板中,轻轻摇匀,锡箔纸包住避光,于37C条件下孵育65分钟。

(3) 釆用多功能酶标仪于530 nm处检测OD值,以蒸馅水作为空白对照。测得数据采用Microsoft Excel做标准曲线。

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2.2.23样品溶液制备及PQQ含量测定

肉灵芝提取液1.5mg/mL)用蒸馄水稀释10倍得肉灵芝提取物的稀释液0.15mg/mL),取上述稀释液80L按照步骤2.2.2.2各步骤检测,测稀释液的吸光度,经换算,得出肉灵芝提取物中PQQ含量。

2.2.3细胞复苏、培养与冻存

本文中所用HepG2LO2细胞均为吉林大学生物大分子实验室提供。这两种细胞均采用DMEM高糖培养基进行培养。

2.2.3.1细胞复苏

1)利用恒温水浴锅加热至37°C水浴快速将细胞冻存管解冻,待冻存液呈液体状态迅速转移到细胞超净台。

2)将冻存液用移液枪吹打混匀后,缓慢转移至15 mL离心筒中,标记好编号,在700 rpm条件下离心4 min

3)吸除离心筒中的液体,使用1 mL移液枪吸取3 mL无菌PBS重悬离心管细胞。

4)按照步骤2)操作后弃去离心筒中的上清液,量取已预暖的细胞培养2 mL加入离心筒中,再次进行细胞重悬。

5)1 mL容量的移液枪将重悬的细胞平均分装到五个细胞培养瓶中,每瓶400L,然后每瓶加入4 mL10%FB S的细胞培养液,拧紧盖晃匀细胞, 把各细胞瓶转移到CO2培养箱(温度37°C, 5%CO2条件下)中进行细胞培养。

6)第二天观察细胞状态,若细胞形状呈三角型或者扁平形则细胞贴壁,弃掉旧培养基,PBS润洗,加入新培养基培养。

7)培养24 h后对细胞进行观察,若细胞铺满瓶底即可进行传代。

2.2.3.2细胞传代

1进行细胞传代培养的条件是细胞状态良好,汇合度高;弃废培养液,无菌PBS清洗。

2)加入适量胰酶(含0.02%EDTA), 37°C条件下消化3-5分钟,细胞由原来的连成一片转变成彼此分离,形状由鳞状变为圆形即细胞消化完成。

3)加入等量的细胞培养基来终止消化。移入15 mL无菌离心筒中,配平, 在800 rpm条件下离心3分钟。

4)用移液枪吸除离心管中的液体,后用2 mL无菌PBS磷酸缓冲液将细胞重新悬浮,配平,在800 rpm条件下离心3分钟。

5)弃掉离心筒内的液体,用移液枪吸取培养基混匀,再吸取少量液体,用血球计数板计数,读取五大格除以五计算平均每毫升含有多少个细胞,按计数结果适当稀释细胞,转入培养瓶,混匀放入培养箱中进行培养。

2.2.33细胞冻存

为了保证以后细胞实验不出问题,多冻存细胞为以后做准备。

1弃废培养液,无菌PBS清洗;培养瓶中加胰酶(含EDTA),使细胞被覆盖。

2)在培养箱37°C, 5%CO2中消化3-5分钟,完成后加同样体积培养液(含10%FBS)终止消化。

3)移入无菌离心筒中,于1000 rpm条件下离心3分钟。弃上清,用已准备好的冻存液重悬离细胞。并进行计数。

4)根据计数结果,釆用冻存液适当稀释,转移至冻存管中,于-80°C48h,后移至液氮罐中冷冻保存。

2.2.4肉灵芝提取物对HepG2LO2细胞存活率的影响

1分别收集对数期终密度约为5x"/mLHepG2LO2细胞,置于96孔板中,每孔100 gL细胞悬液。

2)在细胞培养箱中培养12 h,细胞都贴壁(96孔平底板)即可给药,用DMEM高糖(不含血清)培养液稀释肉灵芝提取物15mg/mL),稀释终浓度分别为0 mg/mL1.5 mg/mL2.25 mg/mL3 mg/mL3.75 mg/mL4.5 mg/mL 6 个梯度,每孔100L,同浓度设6个复孔。

3)培养24小时,后每孔加10LMTT溶液,轻摇混匀,继续培养4h, 终止培养,吸除孔内培养液。

4)每孔加150L二甲基亚碉DMSO),37°C, 100 rpm条件下孵育9 分钟。后采用酶标仪在490 nm处测OD值。

2.2.5肉灵芝提取物诱导HepG2细胞凋亡检测

1将贴壁HepG2细胞以5X105/mL密度接种于六孔板上,六孔板每孔加入2.5 mL DMEM高糖(含10%FBS),在培养箱培养至0.5 d,分别加入无菌肉灵芝提取液至终浓度分别为0 mg/mL, 1.5 mg/mL3.0 mg/mL, 4.5 mg/mL, 其中0 mg/mL为阴性对照组,培养24h

2)弃废液,在4°C冰箱中固定液(4%多聚甲醛)固定细胞15 min

3)吸除六孔板内的固定液,用PBS反复清洗上三遍,加Hoechst 33258 染液,于25°C条件下避光放置lOmino

4)PBS清洗二遍,避光风干,于荧光显微镜下观察并记录结果。

2.2.6流式细胞术凋亡检测

1HepG2细胞进行培养,状态较好时进行传代,细胞长满后进行消化, 后在900 rpm条件下离心3分钟,用移液枪吸取离心筒中的液体,用终浓度1x106/孔HepG2细胞接种六孔板,再行培养12 ho

2)把用DMEM高糖培养基(不含FBS)稀释的肉灵芝提取物0 mg/mL


1.5 mg/mL3.0 mg/mL4.5 mg/mL)分别加到六孔板中,每个梯度1个孔,于细胞培养箱中培养24 h

3)弃废液,无菌PBS清洗。每遍2 min轻轻晃动,把PBS吸干净,分别加入不含EDTA的胰酶各0.5 mL37°C条件下进行消化,直至细胞分离成圆球形。后每孔加入0.5 mL DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用移液枪轻轻吹落细胞,分别转移至4mL无菌EP管中,在1200 rpm条件下离心4钟,弃去上清液。

4)用冷却无菌的PBS进行重悬,于1500 rpm条件下离心4分钟,弃上清液,重复一次,弃上清液。

5)然后用试剂盒中的结合缓冲液每孔各加400 |1L重悬各EP管中细胞,细胞的密度应达到2X 106/mL左右。

6)双染最低需要四个组的细胞用于校准流式细胞仪,另外四个组细胞分别加入不同稀释度的肉灵芝提取液(0 mg/mL, 1.5 mg/mL3.0 mg/mL4.5 mg/mL)o前四个校准组分别是双色都不染色、单染AnnexinV-F1TC单染PI, 双染AnnexinV-FITCPI,后四个实验组都双染AnnexinV-FITCPL按标记加双荧光染料。

7)先分别加入AnnexinV-FITC51L,4°C条件下避光染色15分钟, 后分别加入P10L,4°C条件下避光染色5分钟。

8)采用200目细胞筛网对细胞进行过滤,分别转移到己标记好的流式管中,锡箔纸包好避光。立即釆用巳经开启的流式细胞仪进行分析。

2.2.7肉灵芝提取物诱导HepG2细胞凋亡的细胞周期检测

1接种消化重悬的HepG2细胞于六孔板中,每孔2 mL培养液,大约有106个细胞,放入细胞培养箱中培养12 h

2)12 h后给药,把用DMEM高糖培养基(不含FBS)稀释的肉灵芝提取物稀释好,它的梯度浓度是0 mg/mL1.5 mg/mL> 3.0 mg/mL4.5 mg/mL个梯度作好标记,每个梯度一个孔,把原培养基换成肉灵芝提取物稀释液,培养24 ho

3)弃废液,2次无菌PBS清洗,每次2 min,用手轻轻晃动。用移液枪分别把板上的液体吸除干净,每孔加入0.5 mL的胰酶(不含EDTA)进行消化3-5 分钟,后各加入0.5 mL DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化,分别移至EP管中,在1200 rpm条件下离心3 min,每管大约有1 X 1()6个细胞。

4)弃废液,冷无菌PBS重悬,离心(1200 r/min, 3 min),重复次。

5)75%的冰冻乙醇-20°C固定1 h可在-20C保存样品。

6)对固定的细胞进行离心,弃去上清液,分别用400LPBS重悬细

胞。

(7) 分别加入核糖核酸酶A (RnaseA)溶液各20L,37°C条件下温育

30分钟。

(8) 采用200目细胞筛网对细胞进行过滤,把各EP管中的细胞液转移到对应标记的流式管。

(9) 各加入PI染液400L,4°C条件下避光染色45分钟。立即釆用己经开启的流式细胞仪进行分析。

2.2.8结果统计与分析

本研究结果重复三次以上,实验数据釆用Excel结合GraphPad 5进行统计分析,以GraphPad 5分析差异(*代表显著性差异即P<0.05, **代表非常显著性差异即P<0.01, ***代表极显著性差异P<0.001),均值土标准差(MeanSD) 表示。

2.3实验结果与讨论

2.3.1苯酚-硫酸法测定肉灵芝提取物中多糖含量

通过苯酚-硫酸法测定肉灵芝提取物中多糖含量,标准曲线如图2.1所示。


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2.4小结

肉灵芝提取物釆用苯酚-硫酸法测肉灵芝提取物中多糖含量,结果显示肉灵 芝提取物中多糖含量为165.800± 15.011 mg/gNBT-Gly法测定肉灵芝提取物中毗咯哇嚇醍PQQ)含量,结果显示肉灵芝提取物中PQQ含量为4.198±0.641 mg/go说明肉灵芝提取物中有这两种抗肿瘤活性物质。

MTT实验是检测肉灵芝提取物对肝癌细胞和正常肝细胞的细胞毒性测试,证明肉灵芝提取物对肿瘤细胞和正常肝细胞都有一定的抑制效果,且细胞毒性作用肿瘤细胞与正常细胞LO2细胞)有显著性差异,说明对肝癌细胞HepG2 细胞)有更大的杀伤效果。Hoechst 33258染料对细胞低毒,可特异性的与DNA 结合发出荧光,与DNA的自身结合紧密有关,从Hoechst 33258染色的结果来看,肉灵芝提取物浓度增加,HepG2细胞结合Hoechst 33258染料细胞数量增加,说明HepG2细胞凋亡使细胞膜被破坏,从而使Hoechst 33258染料穿过细胞膜进HepG2细胞与DNA结合。AnnexinV-FITC/PI双染细胞,可以更加清楚的分辨出早凋细胞与活细胞、坏死细胞、机械损伤细胞的区别。结果中的流式细胞凋亡图数据显示,阴性对照组早期凋亡细胞占总细胞数比例为1.41 %1.5 mg/mL (肉灵芝提取物)实验组为20.79 %、3 mg/mL(肉灵芝提取物)实验组为38.72 %、 4.5 mg/mL (肉灵芝提取物)实验组为60.68%。从数据可以看出肉灵芝提取物有促进HepG2细胞早凋的作用。PI单染检测细胞周期,肉灵芝提取物浓度增加使Sub-Gl细胞百分比增加,即凋亡细胞增加。阴性对照组Sub-Gl细胞百分比与实验组Sub-Gl期百分比有显著性差异,说明肉灵芝提取物有促进HepG2细胞凋亡, 使HepG2细胞染色体断裂萎缩。

第三章肉灵芝提取物体内抗肿瘤活性研究

基于肉灵芝中含有多糖、PQQ几丁质等多种活性成分,具有抗氧化、提升机体免疫力、抗菌等作用,以肉灵芝提取物作用于ICR荷瘤鼠,探讨其是否能够通过提高受试鼠的机体免疫力来达到抗肿瘤的目的。本章以注射肝癌细胞H22)ICR荷瘤小鼠为实验对象,进行肉灵芝提取物体内的抗肿瘤活性实验。首先通过向ICR小鼠注射H22细胞进行肿瘤模型造模,然后对ICR荷瘤鼠模型灌胃给药,通过对ICR荷瘤鼠体重、皮下瘤重、免疫器官、巨噬细胞吞噬功能、T细胞和B细胞刺激指数、NK细胞活性、脾脏免疫细胞亚群、血清IL-2IgGIgM的含量等的检测,评价肉灵芝提取物的体内抗肿瘤活性。

3.1实验材料

3.1.1实验样品与实验动物

受试药:肉灵芝提取物,由吉林省白山市林源春生物科技有限公司提供。纯水稀释肉灵芝提取物终浓度为75 mg/mLo

对照药:注射用胸腺法新(商品名:迈普新国药准字H20020545)商品编号:584222,成都地奥九泓制药厂,规格:1.6 mg/支。

实验动物:ICR小鼠SPF级,雄性,20—22 g, 84只,长春亿斯实验动物技术有限公司)。

实验细胞:肝癌H22细胞购自中科院上海细胞库。

3.1.2实验仪器及药品


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.2.4肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响

按照上述3.2.1分组和给药)步骤分组和给药到21 d,阳性药组(注射用胸腺法新0.3 mg/kg)皮下注射到21 d,实验21 d处死小鼠,称量1CR小鼠体重, 取胸腺和脾脏称其重量,计算胸腺系数和脾脏系数,考察药物对免疫器官的保护 作用,并取血备用。






















3.2.5肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏TB淋巴细胞功能影响

按照上述

3.2.6肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

按照上述3.2.1分组和给药)步骤分组和给药到21 d,阳性药组(注射用胸腺法新)0.3 mg/kg)皮下注射到21 d试验结束前3日,所有ICR小鼠腹腔注3%硫代乙醇酸钠溶液3mL21天脱颈处死ICR小鼠,用医用酒精消毒,在无菌环境中,用无菌注射器往小鼠腹部注入无菌1640培养基3mL,吸取腹腔细胞洗涤,离心,培养3 h,消化重悬,细胞计数,调整细胞终浓度为"IO,/mL, 每孔加样(培养24 h的吞噬细胞100L+0.1%中性红100L),96孔板培养4 h,用无菌PBS洗二次,然后每孔加200L溶解剂(50 %冰醋酸,50 %乙醇),120 rpm, 37°C条件下摇床温育30分钟,后采用酶标仪在波长450 nm处测定吸光值,根据吸光值计算各组巨噬细胞吞噬能力。

3.2.7肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏NK细胞功能的影响

按照上述3.2.1分组和给药)步骤分组和给药到21 d,脱颈处死。70%酒精


消毒,无菌环境下解剖脾脏,研磨,混匀脾细胞悬液,红细胞裂解液裂解脾细胞, 4 min后,在1200 rpm条件下离心处理4分钟,弃去上清,重复至无红色为止, 终浓度为5x"/mL的脾细胞被RPMI 1640 (10 % FBS)培养基重悬,在96 孔板中(脾细胞100L/孔与YAC-I细胞100 gL (5x104/mL) /孔,2d)共培养,加10L/MTT培养4 ho弃上清,每孔加150L DMSO,120 rpm, 37°C 条件下孵育10分钟。采用酶标仪在570 nm处测定吸光值,计算NK细胞活性。计算公式如下:

NK 细胞的杀伤活性=[l-(A-B)/C]xl00%3.4)

式中:A是肉灵芝提取物实验孔OD值,B是空白效应细胞OD值),C是对照靶细胞0D值。

3.2.8肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏免疫T细胞亚群的影响

脱颈处死ICR荷瘤小鼠,70%酒精消毒,在无菌超净台里取脾脏,研磨制备细胞悬液,无菌PBS清洗,离心,红细胞裂解,重复离心,重新裂解直到无红色。无菌PBS清洗,离心,光学显微镜下计数,冷PBS稀释细胞终浓度为bio’ /mL,取体积200 gL,Fc受体阻断剂,冰上孵育10 min , PBS洗一次,1000 rpm条件下离心3分钟,按顺序加3种荧光抗体CD3-FITC, CD4-APC, CD8-PE),冰上避光孵育30分钟,釆用PBS清洗二遍,于1000 rpm条件下离4分钟,弃上清,用300L4%多聚甲醛进行固定,转移到流式管中,在已启动的细胞仪中进行检测。

3.2.9肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠血清中IL-2IgG、【gM含量的影响

按照上述3.2.1分组和给药)步骤分组和给药到21 d,阳性药组(注射用胸腺法新)0.3mg/kg)皮下注射到21 do活的ICR小鼠摘眼球取全血,全血用血清分离胶管(黄帽)分离保存,在4笆冰箱静置一天,管中上清液即为血清,取上清,分装,于-80°C保存,参照试剂盒中说明分别进行血清中IL-2IgGIgM 含量的检测。

3.2.10结果统计与分析

实验数据采用Excel进行统计分析,结果以均值和标准差(戏sd)表示,采用GraphPad Prism 5进行One-Way ANOVA (单因素方差分析)评价整体性差异,实验重复三次以上。整体性差异p<0.05时具有统计学意义。

3.3实验结果与讨论

3.3.1肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠体重的影响

首先检测一下肉灵芝提取物是否对H22荷瘤小鼠的体重有影响,生物体的体重是衡量机体是否健康的的一个参考数据,无论是体重偏高和偏低都不健康,
检测各组H22荷瘤小鼠的体重,结果如表3-4所示。

19.png20.png21.png22.png


结果由表3-7显示:与对照组比较,模型组T, B细胞剌激指数降低,即TB细胞功能降低。肉灵芝提取物各剂量具有提高T, B细胞刺激指数的趋势,肉灵芝提取物所有剂量组与模型组相比较都有显著性差异,说明肉灵芝提取物可提高荷瘤鼠的T细胞功能,对B细胞功能有改善趋势作用。阳性药组的T刺激指数增高,B刺激指数无明显变化,说明阳性药可以增强模型组T细胞功能,对B 细胞功能无影响。

3.3.5肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

为了研究肉灵芝提取物能否影响H22荷瘤小鼠的巨噬细胞吞噬功能,而对抗肿瘤起作用。巨噬细胞是由单核细胞分化而来的,具有活跃的吞噬功能,能清除外来侵袭体内抗原物质及异变性的问题细胞,还可以把外来抗原暴露出抗原决定簇,呈递给B淋巴细胞,是B淋巴细胞激活分泌抗体中和抗原。它在天然免疫及适应性非免疫中均起重要作用。它是衡量非特异性免疫的一个重要指标。结果如表3-8所示。

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结果由表3-8显示:模型组与对照组相比,吞噬指数升高,说明小鼠非特异性免疫增强成功。肉灵芝提取物所有剂量组与模型组相比吞噬指数无显著性差异,但也有上升的趋势可能的原因是肉灵芝提取物剂量没有达到;阳性药组与模型组相比吞噬指数增高,但无显著性差异,说明阳性药组对巨噬细胞的吞噬功能没有影响;与对照组相比,给予高剂量受试药物后小鼠吞噬指数升高,有非常显著性差异,说明肉灵芝提取物高剂量组可提高正常小鼠巨噬细胞吞噬功能。

3.3.6肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏NK细胞功能的影响

为了研究肉灵芝提取物能否提高H22荷瘤小鼠NK细胞活性,从而杀伤肿瘤细胞。NK细胞是机体天然免疫中的重要免疫细胞,NKT淋巴细胞和B巴细胞不同不受MHC受体限制,可直接识别和杀伤异变细胞,具有识别、溶解肿瘤细胞及被病毒感染的细胞和产生免疫调节细胞因子68】。现在NK细胞怎么识别肿瘤细胞或其他问题细胞还不清楚,NK细胞可非特异性杀伤和溶解靶细胞,NK细胞分泌一些免疫因子调节免疫细胞促进适应性免疫应答【691NK细胞活性

是衡量天然免疫的一个指标。结果如表3-9所示。

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结果由表3-9显示:模型组NK细胞活性与对照组NK细胞活性相比降低但没有显著性差异。与模型组相比,肉灵芝提取物高、中、低剂量组的NK细胞活性提高,肉灵芝提取物高中剂量组具有显著性差同时存在剂量依赖性关系。注射用胸腺法新组明显提高NK细胞活性,有极显著性差异,阳性药组极大提高NK 细胞的自然杀伤效果提高了荷瘤鼠免疫和抗肿瘤的能力。与对照组相比,给予高剂量受试药物后小鼠NK细胞活性无变化,说明肉灵芝提取物高剂量组对于正常小鼠NK细胞活性不起作用

3.3.7肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠脾脏免疫T细胞亚群的影响

为验证肉灵芝提取物能否提升T淋巴细胞成熟比例,提高T淋巴细胞对肿瘤细胞的抑制。T淋巴细胞在分化、生长、成熟的每个阶段都会表达不同的受体蛋白,成熟的T淋巴细胞表面表达的是CD3+蛋白,成熟的T淋巴细胞比例的多少代表细胞免疫的强弱。CD4+受体主要表达于辅助T细胞Th),Th细胞免疫作用识别的位点,CD4+T细胞可分泌免疫因子和辅助B淋巴细胞免疫;CD8+ 细胞是T淋巴细胞中的另一个亚群,在杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞中起重要作用。CD4+/CD8+比值作为衡量免疫功能的一般指标,其升高/降低反映免疫功能 的增强/抑制。结果如表3-10所示。

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实验釆用FCM检测和分析,结果由表3-10显示:模型组CD3+T淋巴细胞与对照组GD3+T淋巴细胞相比,百分比例显著降低,表明荷瘤可降低CD3+T巴细胞占总数T淋巴细胞的百分比例,降低荷瘤小鼠自身的免疫水平也说明模型组小鼠造模成功;与模型组相比,肉

说明肉灵芝提取物提取物对T细胞亚群有影响可提高T淋巴细胞免疫水平。胸腺肽组CD3+T淋巴细胞比灵芝提取物高剂量组CD3+T淋巴细胞比例有显著性差异,提高了CD3+T淋巴细胞的比例,例较荷瘤模型组显著提高,表明阳性药胸腺肽可提高荷瘤小鼠T细胞免疫水平。

3.3.8肉灵芝提取物对H22荷瘤小鼠血清中IL-2IgGIgM含量的影响

为验证肉灵芝提取物能否对H22荷瘤小鼠血清中的IL-2IgGIgM产生影响,进而抑制肿瘤的生长,实验采用IL-2IgGIgM检测试剂盒检测ICR荷瘤小鼠血清中IL-2IgGIgM的含量,IL-2即白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2), 可直接活化促进B细胞增殖,增强多种杀伤细胞的活性,活化吞噬细胞等功能。是调节免疫的重要因子。IgG即免疫球蛋白G(ImmunoglobLinG, IgG),是血清主要的抗体成分,IgG在抗感染,增强免疫其重要作用,也与自身免疫病有关。血清中IgM (免疫球蛋白M)分子量最大,为970kD,称为巨球蛋白(macroglobLin)免疫球蛋白M在机体的早期免疫防护中占有重要地位,天然抗体多为免疫球蛋白M结果如表3-11所示。

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检测结果由表3-11显示:肉灵芝提取物各剂量组血清IL-2含量与模型组血IL-2含量比较,均有升高的趋势,且与肉灵芝提取物高剂量组相比具有显著性差异,说明肉灵芝提取物有提升血清IL-2含量的作用。肉灵芝提取物各剂量组血清IgG含量和IgM含量与模型组血清IgG含量和IgM含量相比较无显著性差异。说明肉灵芝提取物可提高T细胞分泌细胞因子的功能而对B细胞分泌功能及天然抗体的生成无影响。阳性药组IL-2含量与模型组IL-2含量有很大的提高,且有显著性差异,但阳性药组血清IgG含量和IgM含量与模型组血清IgG 含量和IgM含量相比都无显著性性差异说明阳性药科可提高T细胞分泌细胞因子的功能而对B淋巴细胞的分泌功能和天然抗体的生成无影响。

3.4小结

ICR荷瘤H22)小鼠体内实验结果由表3-4数据可知小鼠模型组H22胞造模成功的ICR小鼠)与空白对照组(正常ICR小鼠)相比体重降低,且第10天以后两者具有显著性差异,说明肿瘤对小鼠体重产生负面影响。而肉灵芝提取物高剂量组与模型组相比小鼠体重具有显著性差异,说明肉灵芝提取物高剂量组有改善荷瘤鼠体重的作用,阳性药组(注射用胸腺法新,0.3mg/kg)与模型组(灌胃纯水的荷瘤鼠)相比从第12天及以后都具有显著性差异,说明阳性药(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg)可有效地扭转模型组(灌胃纯水的荷瘤鼠)体重下降的趋势,高剂量组与对照组比体重降低且一周后有显著性差异说明高剂量肉灵芝提取物可引起小鼠体重降低;肉灵芝提取物组的H22荷瘤鼠模型形成率减少但无显著性差异,说明肉灵芝提取物不能阻止肿瘤的发生。阳性药组与模型组比较H22荷瘤鼠模型形成率无显著性差异,说明阳性药组也不能降低H22荷瘤小鼠肿瘤的成瘤率,肉灵芝提取物高剂量组和阳性药组(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg) 都可减少肿瘤的重量,且它们的平均瘤重与模型组平均瘤重相比具有显著性差异,说明肉灵芝提取物高剂量组和阳性药组(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg)都可抑H22肿瘤的生长。阳性药组(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg)抑制ICR荷瘤小鼠H22肿瘤效果特别好。

肉灵芝提取物高剂量对照组ICR正常小鼠胸腺系数、脾脏系数与空白正常对照组小鼠胸腺系数、脾脏系数相比有点差异但无显著性差异,说明肉灵芝提取物对正常ICR小鼠胸腺系数、脾脏系数无影响。肉灵芝提取物高剂量组与模型组胸腺系数比较有显著性差异,说明肉灵芝提取物对胸腺系数的降低有改善作用。与模型组相比,肉灵芝提取物高、中、低剂量组的脾脏系数下降,但无显著性差异,说明肉灵芝提取物对脾脏系数的升高有改善作用的趋势。阳性药组的胸腺系数增高,脾脏系数降低,都与模型组比较有显著性差异,说明阳性药可以増强模型组胸腺功能,恢复脾脏功能。

模型组与对照组相比T, B细胞刺激指数降低,即TB细胞功能降低,ICR 小鼠免疫功能降低。肉灵芝提取物有提高T, B细胞刺激指数的趋势,其中低中高剂量组与模型组相比较T细胞刺激指数有显著性差异而B细胞刺激指数没有显著性差异,说明肉灵芝提取物高、中、低剂量组可改善荷瘤鼠的T细胞功能但对B细胞功能没有改善作用。阳性药组的T刺激指数增高,B刺激指数无明显变化,说明阳性药可以增强模型组T细胞功能,对B细胞功能无影响;肉灵芝提取物高、中、低剂量组和阳性药组与模型组相比小鼠吞噬指数升高但无显著性差异,说明肉灵芝提取物和注射用胸腺法新对荷瘤鼠巨噬细胞的吞噬能力有稍微改善的趋势,给予高剂量受试药物后小鼠吞噬指数升高,说明高剂量肉灵芝提取物提高正常小鼠巨噬细胞吞噬功能。

模型组(荷瘤鼠灌胃纯水)与对照组相比,NK细胞活性降低,说明肿瘤可降低ICR小鼠的NK细胞杀伤力。肉灵芝提取物高、中、低剂量组与模型组相比,NK细胞活性提高,都具有显著性差同时存在剂量依赖性。阳性药组(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg)与模型组相比可明显提高NK细胞活性,有极显著性差异。给予肉灵芝提取物高剂量的正常小鼠与对照组相比,NK细胞活性没有变化,说明肉灵芝提取物对正常ICR小鼠NK细胞活性没有影响。

T淋巴细胞的流式结果显示:模型组及空白高剂量组ICR小鼠CD3+T淋巴细胞与对照组ICR小鼠CD3+T淋巴细胞相比,CD3+T淋巴细胞占总T淋巴细胞比例显著性降低,表明肿瘤可减少荷瘤鼠中CD3+T淋巴细胞比例,降低荷瘤ICR 小鼠的免疫功能;肉灵芝提取物高剂量组与模型组相比CD3+T淋巴细胞比例提高且有显著性差异,说明肉灵芝提取物高剂量组可提高T细胞免疫水平。胸腺肽组CD3+T淋巴细胞比例与荷瘤模型组相比有显著性提高,表明阳性药胸腺肽可提高荷瘤小鼠T细胞免疫水平。

肉灵芝提取物各剂量组与模型组相比,血清IL-2含量均有升高的趋势,且肉灵芝提取物高剂量组与模型组相比血清IL-2含量有显著性差异。肉灵芝提取物各剂量组血清IgG含量和血清IgM含量与模型组血清IgG含量和血清IgM量比较没有显著差异。IgM含量与模型组也未见显著性差异。说明肉灵芝提取物提高T细胞分泌细胞因子的功能而对B细胞分泌功能及天然抗体的生成无影响。阳性药组(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg)可提高IL-2含量且与模型组1L-2含量相比有显著性差异,说明阳性药可提高T细胞分泌细胞因子的功能。

结论

本课题以肉灵芝提取物为研究对象,对其进行相关抗肿瘤活性成分的含量测定,利用细胞生物学及动物免疫学从体外和体内两个方面阐述对肿瘤的影响,体外细胞选用肝癌细胞HepG2细胞和正常肝细胞LO2细胞,体内荷瘤鼠模型选用肝癌细胞H22细胞进行抗肿瘤活性研究,得到结果具体如下:

1)采用苯酚-硫酸法、NBT-Gly法分别测定肉灵芝提取物中多糖含量、毗咯哇嚇醍PQQ)含量,结果显示肉灵芝提取物中多糖含量为165.800±15.011 mg/g,肉灵芝提取物中PQQ含量为4.198±0.641 mg/g肉灵芝提取物对肿瘤细胞和正常肝细胞都有一定的抑制效果,肉灵芝提取物更能抑制HepG2细胞,且肿瘤细胞与正常细胞细胞毒性作用有显著性差异,说明肉灵芝提取物对HepG2 细胞有更大的杀伤效果。Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-FITC/PI双染、PI 单染检测细胞凋亡,这三种方法分别从蓝色荧光、早期凋亡细胞百分比、sub-Gl 细胞百分比三个量度来测定肉灵芝提取物对HepG2细胞的凋亡情况,结果显示随着肉灵芝提取物浓度的提高HepG2细胞凋亡率或细胞死亡数量升高,说明肉灵芝提取物可诱导HepG2细胞凋亡。

2)ICR小鼠实验中与模型组相比,高剂量肉灵芝提取物有改善荷瘤鼠体重的作用,阳性药组也有极大的改善荷瘤鼠体重的作用;肉灵芝提取物高剂量组和阳性对照组与模型组相比都有抑制荷瘤鼠肿瘤生长的作用,降低荷瘤鼠肿瘤的重量;肉灵芝提取物对正常ICR小鼠胸腺系数、脾脏系数无影响。肉灵芝提取物对胸腺系数的降低有显著性改善作用。肉灵芝提取物对脾脏系数的升高有改善作用的趋势。阳性药可以增强模型组胸腺功能,恢复脾脏功能;肉灵芝提取物高、中、低剂量组与模型组相比可提高荷瘤鼠的T细胞功而对B细胞功能无影响。阳性药组与模型组相比可以增强T细胞功能,但对B细胞功能无影响;肉灵芝提取物各剂量组与模型组比较可提升荷瘤鼠巨噬细胞吞噬功能,但无显著性差异。肉灵芝提取物高剂量正常组与空白对照组相比可提高正常小鼠巨噬细胞吞噬功能,有显著性差异。阳性药组对荷瘤鼠巨噬细胞吞噬功能无影响;与模型组相比,肉灵芝提取物高、中剂量组和阳性药组(注射用胸腺法新,0.3mg/kg)可明显提高NK细胞活性,且都有显著性差异,说明肉灵芝提取物和阳性药可提高NK细胞活性;肉灵芝提取物高剂量组与模型组相比CD3+T淋巴细胞比例提升且有显著性差异,说明肉灵芝提取物高剂量组对T细胞亚群有影响可提高T细胞免疫水平。阳性药组(胸腺肽)CD3^淋巴细胞比例较荷瘤模型组有显著性提高,表明阳性药(胸腺肽)可显著提高荷瘤小鼠T细胞免疫水平;肉灵芝提取物高剂量组血清IL-2含量与模型组血清IL-2含量相比具有显著性提高。血清IgG 含量和IgM含量与模型组比较未见显著差异。说明肉灵芝提取物提高T细胞分泌细胞因子的功能而对B细胞分泌功能及天然抗体的生成无影响。阳性药组(注射用胸腺法新,0.3 mg/kg)IL-2含量较模型组显著性提高,说明阳性药科提高T 细胞分泌细胞因子的功能且对B细胞分泌功能无影响。上述说明肉灵芝提取物H22肿瘤的生长有抑制作用。肉灵芝提取物可保护胸腺、提高免疫细胞活性、增强IL-2因子的分泌、增强机体免疫力,达到体内抑制肿瘤生长的效果。


致谢

时光飞逝,眨眼间硕士就快毕业了,我回想这几年发生的点点滴滴,我不仅收获了知识,还收获了其它重要的东西。

首先我感谢的就是我的导师张淑华,从我的毕业论文开题一直到毕业论文定稿,倾注了老师许多心血,在我研究生期间,我有迷茫的时候感受到老师关心和呵护之情,学业上为我指点迷津,刚开始做实验时,老师悉心指导,实验失败后与我一起寻找实验失败的原因。让我感受到老师关怀,特此向张老师表示我最诚挚的敬意和感谢。

同时我感谢的另外一位老师就是王丽萍老师,我自从到王丽萍老师实验室,她为我寻找毕业开题,给我提供实验说需要的条件,不断督促我的学习给予我实验上的关心和帮助,在毕业论文的撰写上给予我很大的帮助,检查我的实验进度督促我不断地成长,我向王老师表达我最真挚的感谢。我感谢我实验室的师兄、师姐、师弟、师妹和我的同届生对我的关心和日常实验过程中对我的帮助,在我实验遇到困难时寻找我的师兄和师姐的帮助,师兄师姐细心的帮我分析为什么出现这种问题,怎么解决怎么做才更好,我特别感谢的就是汪凯师兄他对我生活上和学习上有诸多照顾,对我在研究生生涯里遇到困难时帮助很大,我对汪凯师兄表示由衷的感谢。

再次感谢那些帮助我、关心我、支持我的两位老师和陪伴我的同学室友以及师兄、师姐、师弟、师妹,在这在这三年里,我们一起学习共同进步,谢谢你们给于我的关心和帮助。

最后需要特别感谢的是我的父母,谢谢父母对我的无私的关心和支持,父母是我求学路上坚强的后盾,他们在背后默默付出和支持,他们无私的爱是我前进的动力,我一定努力回报父母和老师们的期望。

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硕士学位期间取得的研究成果

1. 王朋朋,张丽梅,张淑华*等.五种“药食同源”植物的抗氧化作用研究[J].吉林大学学报(理学版).巳接收.

2. Pengpeng Wang, Shuhua Zhang, Xiaoming Tang.Anti-oxidation of Fraxetin on Caenorhabditis elegans A[C]. 1st CUST&ITMO International Academic Forum. 2017






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