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太岁中细菌DNA提取方法差异及其对菌群结构的影响

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文章附图

太岁中细菌DNA提取方法差异及其对菌群结构的影响

王朝江*,王世清,高春燕,李慧,李聪

(河北省农林科学院遗传生理研究所,河北 石家庄 050051

   :探究不同方法提取太岁中细菌DNA的差异和导致的菌群结构变化,以研磨和热溶解为特点设计提取方法,选择产生目标条带的DNA进行高通量测序分析菌群结构。结果表明,液氮研磨试剂盒法(9)和热溶解过膜CTAB法(SI3)均可提取到有目标条带的DNA,但后者能将太岁组织彻底破碎和去除多糖。SI39只包含1个丰度大于1%的共有OTUSI3含有的1条丰度41.14% OTU使香农指数显著降低。SI3在各分类水平上的优势类群数目均少于9,达到60%绝对优势水平所需优势类群数目更少,二者菌群结构自纲水平上起已产生明显差别。结论:DNA提取方法深刻影响细菌结构,热溶解过膜CTAB法效果好,其获知的优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter,该2属包含在分布不平衡的390个属中。                           

: 太岁;细菌;DNA提取方法;高通量测序;菌群结构

中图分类号: Q938    文献标志码:A     文章标号:

Differences in bacterial DNA extraction methods and the effects on bacterial community structure in Taisui

WANG Chaojiang*,GAO Chunyan,WANG Shiqing,LI Hui, LI Cong

(Institute of Genetics and Physiology of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science, Shijiazhuang, Hebei, 050051, China)

Abstract: The aim of this study was to compare the differences of bacterial DNA extracted from different methods and the resulting changes in bacterial community structure. The DNA extraction methods were based on grinding and thermal dissolution. Meanwhile, the DNA of the obvious target band was selected for high-throughput sequencing. Both the liquid nitrogen grinding kit method (9) and the hot-dissolved membrane CTAB method (SI3) could extract DNA with the target band, however, the SI3 can completely break Taisui tissue and remove polysaccharide. In addition, there was only one common OTU for which the abundance was greater than 1%. However, due to the influence of one OTU, of which the abundance was 41.14%, the shannon index reduced 1.37%. The number of SI3 at each classification level was also less than 9. In addition, the number of dominant groups reaching to the advantage level of 60% was significantly less than 9. There was a significant difference between the two populations at the level of the class. Conclusion: The difference in bacterial DNA extraction methods in Taisui had a profound influence on the structure of the community. The thermolyzed membrane CTAB method was better than 9. The dominant bacteria were Pseudomonas and Acinetobacter.   The two genera were included in 390 genera with unbalanced distribution.

Keywords Taisui; bacteria; DNA extraction method; high-throughput sequencing; bacterial community structure

太岁是一种在中国古籍有多处记载[1],现代又不断发现的神秘物体[2]。1992年在陕西省周至县渭河发现了现代首例太岁,中国中央电视台为此制作了《陕西渭河“烂肉团(太岁)”揭秘记》专题节目,引起了社会巨大轰动,日本明仁天皇曾前去参观[3]

太岁主要特征是外观近圆柱状或球状,内部多呈纤维状纹理,质感如肌肤有弹性(图1)。发现位置主要是地面土层。



现代首例太岁鉴定为粘菌复合体后[3],又被研究者以主要成分为聚乙烯醇而自我否定,但鉴于其中含有大量细菌、霉菌及少量酵母菌的矛盾事实,未作出太岁为非生命体的定论[4-6]。王朝江对现代太岁228次发现与分布规律的分析,证明太岁的发现纯属偶遇,不存在统计意义上的造假,是一种客观存在,只是人类对其尚缺乏认知[7]

细菌是采用培养方法研究太岁内部组织时,菌落数量较之真菌远为多的菌类[6, 8 - 9] ,16S rDNA克隆文库方法研究亦证明细菌种类丰富[10]。据此推断,细菌应在太岁形成中起重要作用。

高通量测序作为第二代测序技术,能够一次并行几百万到上千万条DNA 序列进行测序,对认识太岁中细菌种类具有很大的应用价值[11,12]在采用高通量测序等非培养方法研究太岁中细菌种群时,发现操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)数量多达519至1551种,多样性非常丰富。但在不同太岁间,优势种类差别很大,有短波单胞菌属(Brevundimonas[10]Edaphobacter属、梭菌属(Fusiformis)、芽孢杆菌属(Bacillus[13]、盐单胞菌属(Halomonas[12]等,不存在共有且占比均大的属。同一太岁内,排名前三位属的丰度相加,大都无法形成占比超60%的绝对优势,这和太岁由某种细菌构成,该菌应占绝对优势的假设相差甚远。

非培养方法研究种群结构,是对DNA样品物种信息的翻译和解读。因此,DNA样品提取方法和所含信息的代表性,将对菌群结构产生决定性影响[14,15]。上述研究中DNA的提取,均采用常规材料处理方法。笔者在长期分离研究中发现,以很小量的太岁组织做种源稀释涂板,极易培养出大量的细菌,却提取不到DNA,使人怀疑其与太岁质地如胶,不溶于冷水,含有大量多糖类物质(包括聚乙烯醇)的特性有关系

    目前,没有有关太岁中细菌DNA提取方法的研究报道,更没有不同提取方法对菌群结构影响的研究报道。因此,本文率先开展这方面的研究,希望对正确获知太岁细菌结构,揭示其形成之谜产生积极指导价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料   

供试太岁发现于黄河岸边,重量约20 kg,形状似尖圆柱体,手感如硬橡皮,表皮和内部组织呈褐色。DNA提取用样,按无菌操作要求取自表皮下2~3 cm处。取样后,称重每份0.2 g,共计4份,切成厚度小于1 mm的碎屑。

1.2 试剂仪器

DNA提取试剂盒(E.Z.N.A. Soil DNA Kit,OMEGA,美国);十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,天津市大茂化学试剂厂,分析纯);溶菌酶(solarbio),2×Taq master Mix(Transgen,Vazyme);DNA检测试剂盒(Qubit 3.0,Life)。

台式离心机(H1850,湘仪);电泳仪(DYY-6C型,北京六一),PCR仪(T100,BIO-RAD);Miseq高通量测序平台(2×300,Illumina,美国);针头滤器(0.22 μm,Millex,美国)。

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理与DNA提取方法

DNA提取方法分设4种。①液氮研磨试剂盒法(9):取样经研磨后,用OMEGA试剂盒提取。②~④为CTAB法,均需要在太岁肉热溶解后进行,并使用溶壁酶。热溶解即是将样品置于加有10 mL无菌水的试管,在该太岁溶化温度(预测为85 ℃)下,8 min内振荡溶化。溶解液直接提取的为方法②。溶解液12 000 r/min离心后取沉淀提取为方法③。溶解液经针头滤器过滤后,用滤膜提取为方法④(SI3)。滤液用细菌16s rDNA V3-V4通用引物(341F,805R)扩增检查细菌DNA存在情况。DNA用试剂盒测定浓度,琼脂糖凝胶检测(点样量8 µL)完整性。

提取方法评价指标除DNA浓度、完整性外,主要看组织裂解、多糖类物质去除情况。

1.3.2 PCR扩增及高通量测序方法

选取提取方法①和②~④中效果好的DNA样品为模板,采用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)扩增细菌16S rDNA的V3-V4区。PCR反应体系(30 µL):2 × Taq master Mix 15 μL,上下引物各1 µL,模板DNA 1 µL,ddH2O补足至30 µL。PCR反应条件:94℃ 3 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,5 个循环;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,20 个循环;最后72 ℃延伸5 min。接着进行第二轮扩增,引入Illumina桥式PCR兼容引物,反应体系如上述,反应条件为95 ℃ 3 min;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,5 个循环。通过1%琼脂糖凝胶电泳来观察PCR产物。PCR产物经胶回收后,Qubit 3.0检测DNA浓度,等量混合后测序。

1.3.3 数据预处理与OTU分布分析

剔除3'端引物接头序列,根据PE reads之间的overlap关系将成对reads拼接(merge)成一条序列。按照barcode序列区分不同样本数据。原始数据质控过滤,得到有效序列。Usearch去除非扩增区域序列,而后对序列进行测序错误校正,uchime鉴定嵌合体。去除嵌合体的序列进行blastn比对,剔除低于阈值的靶区域外序列,得到最终优质序列。在97%的相似水平下,使用UsearchVersion 5.2.236优质序列聚类,划分OTU。

1.3.4 细菌Alpha多样性分析

根据聚类结果,分析单样品的Alpha多样性,包括有反映群落丰度分布的Chao 1指数和ACE指数,反映分布多样性的香农(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数。稀释曲线(Rarefaction Curve)包括丰富度和香农指数稀释曲线。文库覆盖率(Coverage)反映测序数据深度和真实性。

1.3.5 细菌分类学分析

选择OTU中丰度最高的序列作为代表性序列,采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU 代表序列进行分类。根据分类结果,在门、纲、目、科、属水平上进行物种分类和丰度统计。

1.3.6样品SI3优势属内优势OTU分析

调取热溶膜过滤法样品(SI3)优势属中OTU的数目、序列数和在总序列内占比数据,分析丰度最高OTU对优势属的支撑作用。

2 结果与分析

2. 1 不同DNA提取方法效果

方法①,液氮蒸发初期,碎屑被研磨成末,但随着温度回升,碎末重新粘聚成泥条状,裂解阶段呈沉淀状态,回收裂解液时被离心弃去;加氯仿去多糖阶段,几无絮状物产生。

热溶能使碎屑几乎全部溶解,变成粘滞性液体。方法②在去多糖阶段,有大量絮状物产生,需重复2~3次氯仿异戊醇处理才能去除干净;DNA沉淀阶段,需将液体转移到约100 mL的容器中,再反复离心才能将DNA浓缩至1管,耗时很长。方法③经多次离心,却未观察到形成明显的菌体沉淀。方法④在去多糖阶段,有少量絮状物产生。

4种方法提取的DNA和滤液中是否存在细菌或其DNA的扩增产物电泳图如图2。


可以看出,方法①、方法④有较清晰的目的条带,大小约为23 000 bp,DNA浓度各为9.4 ng/µL10.2 ng/µL,方法②为小于300 bp的拖尾,方法③无条带。表明方法①提取的DNA,仅来自样品表层的菌体;方法②由于大量多糖的干扰,提取不到大分子量的DNA;方法③因溶解液的粘滞性,菌体不沉降而提取不到DNA;方法④是基于组织彻底破碎基础上提取的DNA。另外,0.22膜滤液中不存在细菌或其DNA,表明滤液中无细菌菌体,热溶解没造成细菌的裂解破坏。

方法①和方法④提取的DNA,分别编号9和SI3,用作高通量测序分析样品。

2.2 测序数据与OTU分布

9和SI3分别测得原始序列49 384和57 394条,质控之后有效序列46 609和53 328条,集中在401~435 bp之间;去除嵌合体和非靶区域的最终优质reads分别是34 003和46 676条,97%相似水平下各聚类为941 和1 095个OTU。

两个样品的OTU韦恩图如图3所示。


从图3可以看出,9和SI3两样品共有OTU为198个,占各自OTU总数的21.04%、18.08%。共有OTU中,只有OTU9,序列占比在各样品中均高于1%,分别为1.49%和5.14%。表明两种方法提取DNA的细菌信息差别极大。

2.3 细菌Alpha多样性

反映2个测试样品α多样性的指数见表1。

表1   2个样品的Alpha多样性指数

样品编号

ACE

Chao1

Shannon指数

Simpson指数

9

1025

974

4.45

0.03

SI3

2881

1920

3.08

0.20

从表2中可以看出,指数之间呈现矛盾的现象。反映菌群丰度的ACE和Chao 1指数,SI3高于9号,而反映菌群多样性的Shannon和Simpson指数却相反。由于香农指数同时受种类数目和种类中个体分配的平均性(equitability)或均匀性(evenness)影响。种类数目多,可增加多样性,种类之间个体分配的均匀性增加也会使多样性提高。SI3测序数据中,包含一条占比达41.14%OTU,由此显著降低了序列的均匀性,导致SI3香农指数下降。

2个样品的丰富度稀释性曲线和香农指数稀释性曲线见图4、5。


从图4、5可以看出,丰富度曲线中,9 先于SI3趋向平缓,表明SI3可能仍有一些种类未被测到;Shannon指数稀释曲线中,9 和SI3均已经进入平台期,说明高通量数据量足够大,包含了样品中绝大多数的细菌信息。

另外,2个样品的文库覆盖率分别为99.59%和98.81%,进一步说明测序结果能较好地反映样品的真实情况。

2.4细菌分类与丰度

为最大限度的反映出两种DNA提取方法带来的细菌种群差别,同时读取了OTU的ratio和reads两个数值,统计在门、纲、目、科、属上的数目(表2)。

2   两个样品在不同分类水平上的数目统计

样品编号

SI3

ratio

17

28

43

89

160

reads

22

37

53

116

232

009

ratio

25

41

59

126

260

reads

25

44

63

131

278

从表2可以看出,9和SI3在不同分类水平上的种类数量都非常丰富。但在各分类水平上,依据ratio的统计数值均低于reads的统计数值,SI3比9优势类群数目均少约20%。减少的各分类水平数量,是其reads占总量比例过低,按百分数统计时,因保留小数位数的原因而取零值。表明不同DNA提取方法测得的细菌种群变化显著。

门分类水平上,样品SI3比9减少8个门,其中,Hydrogenedentes、无壁菌门(Tenericutes)两门reads仅为1~2条,统计原因归零,其余6个门根本没检测到。这8个门在样品9中,热袍菌门(Thermotogae)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)两门ratio值为0.02,其余均为0.01。故这8个门都是含量极微的门。

优势门(相对丰度>1%)数量上,SI3样品拥有4个门:变形菌门(Proteobacteria,90.77%)、厚壁菌门(Firmicutes,1.89%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,2.01%)放线菌门(Actinobacteria,4.06%),占整个细菌总量的98.73%;9号样品同样是以上4个门,占整个细菌总量的98.06%,但是占比却依次为44.86%、31.59%、19.86%、1.75%。SI3与9比较,变形菌门的丰度提升1倍,成为绝对优势门,厚壁菌门和拟杆菌门丰度降幅巨大。

纲分类水平上,从表面看,样品SI3比9减少13个纲,若加上在SI3检出而在9中未检出的2个纲,实际相差15个纲。减少的13个纲,在样品9中占比之和为0.79%,其中,ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)占比最高,为0.41%,酸杆菌纲_Gp4(Acidobacteria_Gp4)次之,为0.09%。SI3检出的丰佑菌纲(Opitutae)和热微菌纲(Thermomicrobia),占比之和为0.11%。15个纲总共相差0.9%,对菌群结构影响不大。

优势纲(相对丰度>1%)数量上,样品SI3拥有5个纲:γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria,74.1%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,12.1%)、放线菌纲(Actinobacteria,4.05%)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria,4.04%)、芽孢杆菌纲(Bacilli,1.72%),占整个细菌总量的96.01%。9号样品则是8个纲,以上5个纲占比依次为14.94%、22.83%、1.74%、6.38%、15.55%,另外还有3个纲:(Bacteroidia,15.55%)、梭菌纲(Clostridia,5.12%)、(Sphingobacteriia,3.16%),占细菌总量的95.99%。SI3与9相比,γ-变形菌纲占比上升了59.16%,成为绝对优势纲,α-变形菌纲占比降低10.73%,但仍以12.1%的比例居第二位,芽孢杆菌纲则下降24.55%,幅度最大,位次由第一降为第五。

目分类水平上,样品SI3和9相差28个目,其中,比后者少22个目,多检出6个目。22个目占比之和为0.94%,弯曲菌目(Campylobacterales)占比最高,为0.41%。SI3多检出的6个目占比之和为0.62%,嗜甲基菌目(Methylophilales)占去一半。28个目总共相差1.56%,对菌群结构影响轻微。

优势目(相对丰度>1%)数量,样品SI3拥有9个,占比之和为94.03%,假单胞菌目(Pseudomonadale)独占66.01%,高出第二目根瘤菌目(Rhizobiales,6.38%)、第三目黄色单胞菌目(Xanthomonadales,6.12%)许多;9号样品则是12个目,占比之和为94.13%,芽孢杆菌目(Bacillales)占比21.92%,排位第一,拟杆菌目(Bacteroidales)占比15.57%,排位第二,也均是降幅第一、第二的目,假单胞菌目则跃升为56.09%,成为明显优势目。

属的分类水平上,样品SI3和9相差212个属,其中,比后者少100个属,多检出56个属。100个属占比之和为26.11%,其中,占比大于1%的属有8个,Barnesiella占比最高,为3.69%。多检出的56个属占比之和为4.47%,Shinella占比最高为0.79%。两个样品中,有大量互不检出属的存在,尤其是有占比较高的属,说明样品间存在差别,即太岁组织在细菌的种类和数量上不是均匀的,有相当数量的菌群属于机会菌群或混杂菌群,换言之太岁是不均匀混杂有多种细菌的杂合体。

两样品共有属104个,优势属(相对丰度>1%)数量上,样品SI3拥有10个,占比之和为82.28%,样品9号则有23个,占比之和为85.32%。其中,与SI3仅共有3个属,且占比变化巨大。假单胞菌属(Pseudomonas,Genbank:MK611758)由7.27%升至48.32%;不动杆菌属(Acinetobacter,Genbank:MK611759)由1.15%升至15.92%,成为SI3中占比前两位的优势属;未分类属(unclassified)占比则由15.55%降至4.84 %。

若以占比超过60%为某一分类水平上,成为绝对优势类群的标准,统计达到此标准所需该水平分类名称的数目和占比,发现两个样品的种群结构差别巨大,SI3凸显了假单胞菌属一个种群,其为第一优势属,高出第二优势属2倍(表3)。由于该变化与特定提取方法相联系,因此,热溶膜过滤法是提取太岁全部细菌DNA的有效方法。

3   两样品在各分类水平的最优分类和达到绝对优势所需分类数目

分类

水平

SI3

9

最优分类

绝对优势

最优分类

绝对优势

名称

占比%

数目

占比%

名称

占比%

数目

占比%

Proteobacteria

90.77

1

90.77

Proteobacteria

44.86

2

76.45

Gammaproteobacteria

74.1

1

74.1

Bacilli

26.27

3

64.65

Pseudomonadale

66.01

1

66.01

Bacillales

21.92

5

64.6

Pseudomonadaceae

49.46

2

65.98

Bacillaceae

19.23

9

63.34

Pseudomonas

48.32

2

64.24

unclassified

15.55

9

61.45

2.5 样品SI3优势属内优势OTU分析

    SI3中三个优势属,假单胞菌属、不动杆菌属、未分类属所含OTU数目,序列丰度最高OTU在所在属内序列、总优质序列的百分占比情况见表4。

4   优势属内OTU数目及丰度最高OTU占比情况

优势属

属占比(%

OTU数目

最优OTU/

OTU占比(%

Pseudomonas

48.32

169

85.13

41.14

Acinetobacter

15.92

61

79.5

12.66

unclassified

4.84

399

29.54

1.43

可以看出,假单胞菌属、不动杆菌属中,虽然包含大量种类,但均有1个占绝对优势的OTU;未分类属优势的形成则是多个低丰度OTU的累积。表明太岁中的细菌存在少至1~2个优势种。反而言之,若假定太岁由细菌构成,其种类仅1~2种。

综上所述,样品SI3获知了比9优势种群高度集中的菌群结构,其属以上的分类树状图如图6。图中未分类属归在other类。

3结论与讨论

3.1 不同方法提取的DNA菌群结构差异大

提取方法不同,决定着能否提取到太岁细菌DNA;提取到的DNA,还因提取方法的差异,决定着其含有的细菌信息是否全面,进而决定着高通量测定的菌群结构。采用热溶膜过滤法,和液氮研磨试剂盒法相比,优势菌群发生了巨变。样品SI3中,假单胞菌属中最优OTU所占序列19260条,在样品9中仅占59条,相差326倍。说明,DNA提取方法不合适,即使大量存在的菌类也不能检测出来。据此推测,之前非培养方法研究的5个太岁[10, 12-13],优势菌群差别大原因,除太岁不同外,还决定于DNA提取方法,此点也明显反映在9号太岁和黄河太岁间。这两个太岁产地相同且形态类似,不但无相近优势菌群,还相差甚远,9号太岁中占比7.64%的第二优势属假单胞菌属,竟未能进入黄河太岁的前20个优势属。黄河太岁提取DNA采用的也是常规CTAB法,未对材料施以彻底破碎和去多糖前处理。因此,热溶解膜过滤法是一种能够获知太岁细菌真实全面信息的DNA提取前处理方法。

3.2 太岁中细菌种类多分布不均优势菌突出具多重意义

样品间存在大量独有属的结果,首先提示太岁中细菌分布不均衡的杂合体,其中绝大多数种类是机会性存在。据此推测太岁在形成过程中,不断裹挟进受环境影响变化的杂菌类群,而不同于所谓的聚乙烯醇脱模物形成过程[16],因为胶体的生产和脱模过程中必有多次搅拌操作,其中的内含物质包括菌类应是均匀分布的。

若将统计归零的74个属,样品9独有的156个属都计算在内,供试太岁中细菌可达390个属。如此多的细菌同时存在于组织内部,在生物体内,只有消化系统 [17] ,而太岁并无此类结构,提示大部分菌来自环境。上述属中,优质序列占比小于0.1%有183个属,占比之和3.78%;占比0.1至1%之间的属有41个,占比之和13.92%;剩下的10个属,占比之和82.28%,提示太岁是有优势菌群的生命体。生命的主体即假单胞菌和不动杆菌,推测其不断分泌多糖类物质,流延性生长中,不断裹挟环境中的其它菌类,被动形成了多种细菌共存的杂合体。但目前发现的假单胞菌并无形成大型块状菌落的能力[6, 9]。因此,深入研究太岁,极可能发现具有这种能力的细菌新物种。

3.3菌群结构的结果影响对太岁认知

太岁主要生于地下,若是生物体,理应是某种菌类或是具有菌类营养方式的未知物种。因此,探讨菌群结构的意义在于探讨其生物学分类地位。既往研究中,因没有发现共有的大量菌群,也没有发现有一个高占比优势属,形成了对太岁本质的多种不利猜测。或认为太岁是化工胶体,细菌为裹挟物[16];或认为细菌与太岁本体无关,是其同生境共存微生物[13];或认为太岁不是一个单一的物种,细菌只是构成太岁的一部分[12]。然而,在做培养时,出现数量最多的菌类还是细菌,并且本研究找到了优势类群。此时若舍弃细菌为主要类群的探索而转向其他菌类,将误导太岁研究走向歧路。

参考文献:

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附:作者王朝江联系方式

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